亲和层析-2.ppt

亲和层析 3 6洗脱 elution 3 6 1专一性洗脱 竞争性洗脱 将相同的配体或配体类似物加入缓冲液中 浓度0 05 0 1mol L 亲和层析 3 6 2剧烈条件洗脱 用盐酸胍 尿素等变性剂配制洗脱液 要用适当的方法使蛋白质复性 亲和层析 3 6 3非专一性洗脱 1 改变pH 2 调节盐浓度 3 添加某些添加剂 有利于洗脱 如 乙二醇 NaCNS 脲素 盐酸胍等 亲和层析 1 改变pH 用弱酸 弱碱调节 亲和层析的pH范围为 pH3 12 亲和层析 2 调节盐浓度 恒定洗脱 isocraticelution 适用于样品纯度较高时 亲和层析 分步洗脱 stepelution 用二种以上洗脱缓冲液洗脱 亲和层析 梯度洗脱 gradientelution 用连续的梯度洗脱液洗脱 亲和层析 3 7亲和层析柱的再生和清洗 3 7 1清洗 连续用大量洗脱液或高浓度盐溶液彻底清洗层析柱 再用平衡缓冲液重新平衡层析柱 亲和层析 3 7 2再生 亲和层析柱若污染明显 应再生处理 可用低浓度的酸 碱 促溶剂3mol L的NaCNS 变性剂6mol L脲素 6mol L盐酸胍 70 乙醇 表面活性剂等处理 亲和层析 第四节提高吸附剂的操作容量 4 1在配体和基质之间引入 手臂 4 1 1原理对小分子配体 为减少空间位阻 可在基质与配体之间插入若干碳原子 手臂 将有利于配体与目标物的结合 亲和层析 4 1 2制备 常用手臂 适当长度的氨基化合物 如 乙二胺 1 6己二胺 6 氨基己酸等 亲和层析 配基偶联后 残留的未反应的 手臂 需进行电荷掩蔽 blocking 目的 减小非特异性吸附方法 用醋酸酐掩蔽 亲和层析 4 2增加配体的取代程度 方法 提高活化时的pH 或增加活化时的BrCN的量 可增加配体的取代程度 提高配体浓度 亲和层析 4 3减少配体与基质之间连接的键 蛋白质 多肽等配体 当它们以最少的共价键与基质偶联时 有利于保持配体的立体结构 保持其生物活性 提高亲和吸附量 蛋白质与基质偶联时 是以游离氨基 NH2 与活化的琼脂糖连接的 亲和层析 4 4基质多孔性对吸附量的影响 1 以琼脂糖为基质的亲和吸附剂 制备后 基质多孔性下降小 吸附量稳定 2 以Bio gelP为基质的亲和吸附剂 制备后 多孔性下降多 导致吸附量下降 亲和层析 4 5影响操作容量的其他因素 样品浓度 离子强度 pH 流速 亲和层析 第五节应用 1 纯化抗体 抗原及其结合物例 用SPA SepharoseCL 4B亲和吸附剂分离IgG 抗原等 亲和层析 2 纯化糖蛋白用Lectin Sephrose4B亲和吸附剂 可分离各种糖蛋白 亲和层析 3 分离核酸例 用poly U Sephrose4B亲和层析载体 来分离纯化mRNA 亲和层析 本章小结 1 原理 利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法 亲和层析 2 操作过程 1 偶联 2 装柱 平衡3 上样吸附 形成M L S复合物 静电引力 范德华力 结构互补 4 缓冲液淋洗 去除杂蛋白 5 洗脱剂洗脱 改变pH 离子强度 亲和层析 3 亲和吸附剂的制备 溴化氰活化法 环氧氯丙烷活化法两种方法的比较 适用情况 亲和层析 4 亲和层析柱操作过程 装柱 平衡 上样 淋洗 洗脱洗脱方法 专一性洗脱 配体 剧烈条件洗脱 变性剂 表面活性剂等 非专一性洗脱 改变pH 离子强度 亲和层析 5 提高吸附剂的操作容量的