2011分子生物学实验讲义8.doc

生物工程教学实习-分子基础实验实验一(1) 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化一、实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 二、实验原理转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。 转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法。感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 本实验以 E.coli DH5 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。转化的质粒 DNA 的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 三、实验仪器、试剂超净工作台；台式高速冷冻离心机；恒温空气摇床；恒温培养箱；培养皿大肠杆菌DH5LB培养基，（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g,溶解到1升蒸馏水中，调PH7.0,灭菌）0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素pUC18质粒 四、实验步骤 菌株活化1用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时2挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于37培养35小时3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养12小时，到OD6000.30.8感受态细胞制备4将培养液8mL在冰上放置1530min，4000rpm离心5min,弃上清（4度）5加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，转入1.5ml离心管中6冰上预冷30min，4000rpm离心5 min,弃上清7加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。转化8吸取200ul感受态细胞转移到无菌的离心管中，每管中加入质粒DNA1ul(不超过2ul),于冰上放置30min，设置对照不加质粒只有感受态细胞。9于42水浴90S（增加DNA吸收）10冰上放置2min11加入800lLB液体培养基于37培养1小时12将200ul培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上（可以设置涂布20uL对照）13将平板放置于37恒温培养箱中培养14-16个小时，然后观察结果对照组 吸取200ul感受态细胞转移到无菌离心管中，加入2 ul无菌水，于冰上放置30min，接着9步做下去 转化率氨苄储备液;100mg/mL,卡那储备液50 mg/mL,培养基中总浓度为:氨苄50ug/ml,卡那，25 ug/ml。固体培养基在60以下添加。五、实验报告画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率（质粒0.05ug/uL*10uL）。实验一(2) 转化子DNA的快速鉴定一、实验目的 1、选择性培养基上的转化子为材料检测重组质粒DNA分子的大小，选出合理的重组的转化体菌株。 2、掌握快速细胞破碎法，测定大小不等的质粒DNA。二、实验原理 利用Cracking gel缓冲液，采用快速细胞破碎法直接从菌体中提取DNA三、实验操作转化子鉴定步骤：（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的50ml LB中，37振荡培养至A590值为0.60.8。（2）取1.2ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。（3）加入70l Cracking Gel缓冲液1mol/L Tris HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml，混匀后，37水浴30min以上。（4）15000rpm离心15min。（5）（实验三）吸取上清点样电泳，观察。思考题1、Cracking gel中各成分的作用分别是什么？2、培养基中添加抗生素的作用是什么？实验二 质粒DNA的提取、酶切与鉴定一、目的掌握质粒的小量快速提取法；了解质粒酶切鉴定原理。二、原理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。主要原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的，细菌在氢氧化钠和SDS溶液中裂解，蛋白质和DNA变性但是染色体DNA氢键断裂，双螺旋解开，质粒DNA也会发生这种变化，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，用PH4.8乙酸钾将其PH调制中性，变性质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构。质粒DNA分子量一般在106107道尔顿范围内。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。如：EcoR和Hind的识别序列和切口是： EcoR：GAATTC Hind：AAGCTTG，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。三、实验材料、主要仪器和试剂1主要仪器（1）塑料离心管1.5mL30（2）塑料离心管架1（3）微量加样器10L、100L、1 000L各一支（4）常用玻璃仪器及滴管等（5）台式高速离心机（20 000r/min）（6）电泳仪（7）电泳槽（8）样品槽模板2材料大肠杆菌DH53试剂（1）pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）；用前加溶菌酶4mg/mL。（2）pH 4.8乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5mL冰乙酸，28.5mL H2O）（3）酚/氯仿（11，V/V）：酚需在160重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓度为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（241，V/V）。（4）pH 8.0 TE缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA酶（RNase）20g/mL。（5）TBE缓冲液：称取Tris10.88g、硼酸5.52g和EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200mL，用前稀释10倍。（6）溶液II ,0.2mol/LNaOH,1%SDS(必须新鲜配置)四、操作步骤1培养细菌将带有质粒的大肠杆菌DH5接种在LB液体培养基上，37培养2448h。2从细菌中快速提取制备质粒DNA，后面依次扩大加的溶液。（1）收集7.5ml菌液，离心12000rpm,1min,弃去上清液。加入150L 预冷的的G.E.T.缓冲液，强烈震荡混匀。（2）加入200L新配置的0.2mol/L NaOH，1%SDS（现用现配）。加盖，快速颠倒4 6次使之混匀（勿剧烈）。冰上放置4 min。（3）加150L冷却的乙酸钾溶液，加盖后颠倒数次混匀，冰上放置5 min。10 000r/min离心5 min，上清液倒入另一离心管中。（4）向上清液中加入等体积酚/氯仿，震荡混匀，10 000r/min离心2 min，将上清液水相转移至新的离心管中，弃有机相。（5）加1/10体积的3mol/LnaAc(NaAc+HAc,PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，于-20放置15分钟。离心14000rpm*15min,弃去上清。（6）加1mL 70%乙醇，旋转洗涤，倒掉洗涤液，真空抽干，待用。加TE50uL溶解沉淀。加Rnase1-2uL混匀，置37水浴30min后，进行限制性内切酶酶切实验。或者于-20保存待用。3 质粒DNA的酶解将自提质粒加入20L的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解。取清洁、干燥、灭菌的具塞离心管编号用微量加样器按表1所示将各种试剂分别加入每个小离心管内。表1 DNA酶切加样表7ul ddH2O2uL10*H.Buffer1uL限制酶（10U）10uL质粒DNA(1ug),注：购买质粒加0.5uL.* 如果体积不到20，补无菌双蒸水至20L，依实际情况做相应调整加样后，小心混匀，置于37水浴中，酶解23h，反应终止后，各酶切样品于冰箱中贮存备用。五、思考题1染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？实验三(1) 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 一、 实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。二、 实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。1变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。三、实验材料及相关试剂 基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳系统、加样器、枪头、DNA模板、引物1、引物2、dNTP、Taq酶、Eppendorf管等四、实验步骤1模板DNA的抽提：实验一所得的基因组DNA。2PCR操作 (在冰上操作)：（1） PCR反应混合液的配制：反应体系25 L, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样： 反应物体积/L终浓度ddH2O12n10 x Buffer 2.5n1 x25 mmol/L MgCl22.52.5 mol/L10 mmol/L dNTP4n（14）200 mol/L10 M上游引物0.5n100pmol/L10 M下游引物0.5n100pmol/L DNA Taq聚合酶1n1 UPUC18引物：产物长度：632bp引物购买后2OD先离心后约加入420uLddH2O,使浓度为10uM.上游引物：5 CGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTA 3下游引物 5 GGGAGTCAGGCAACTATGGATGAA 3（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24L反应混合液，再加2-3L模板DNA。（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：PCR条件：预变性94度，5分钟；变性94度，1分钟；退火55度，45秒；延伸72度，1分钟；循环35次；过度延伸10分钟。（4）注意事项由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。a. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。c. 每加一种反应物，应换新的枪头。3PCR产物的检测： 思考题：1 PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？2 为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？3 用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？实验三（2） DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。迁移速度与分子量的对数值成反比关系。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNAIDNAocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。2、支持物介质琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的DNA分子。3、电场强度电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过4V/cm。而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。4、缓冲液离子强度核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA损伤不是很大，所以也比较适用。使用溴化乙锭对DNA样品进行染色，可以在凝胶中加入终浓度为0.5g/ml的EB。EB掺入DNA分子中，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，但是如果要测定核酸分子大小时，不宜使用以上方法，而是应该在电泳结束后，把凝胶浸泡在含0.5g/mlEB的溶液中1030min进行染色。BE见光分解，应在避光条件下4保存。三、材料、试剂及器具1、材料Marker（分子量标准）；质粒提取物；酶切产物。2、试剂加样缓冲液（6x）：0.25%溴酚兰，40%蔗糖；琼脂糖；酶液（10mg/ml）。3、器具（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。（2）紫外透射仪。四、操作步骤 琼脂糖凝胶电泳步骤：琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 l / 100 ml TBE）（1）制胶（以150 mL为例） a. 称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。 b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量; c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50），倒入其中，直至厚度为46 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30 45 min)； d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 （2）点样 a. 将样品稍微离心，将2.0 l 溴酚蓝加入到小离心管中，混匀； b. 每孔点样15.0 l，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。加样顺序： marker(9uL)、自提质粒、标准质粒(10uL 稀释)、自提酶切、标准酶切、快速鉴定、自提PCR、标准PCR。（3）电泳 打开电源开关，调节电压至35 V/cm(约120 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。（4）染色 将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色5-10分钟。（5）观察将电泳