原位杂交手册.doc

第1章 共用程序引 言： 本章介绍了本实验最基本的实验程序，包括中期染色体制片；质粒的转化与DNA的提取；探针标记检测以及基因组总DNA的提取第1节 原生质体染色体制片试 剂：饱和a-溴萘、0.075MKCl、固定液（新鲜3：1甲醇冰乙酸）、酶解液（20%纤维+2%果胶酶）、IN HCl、95%酒精实验步骤：浸 种 室温下浸种约一天（也可1-2h）发 芽 培养皿中垫湿滤纸三层，利子分散其上，间留间隔，勿堆积，种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸，25-30下发芽，每天水洗一两次，约2-3天可取根。NOTE：换水是很重要的，水不能过多，以不留流动水为好，水分过多易长芽而根长不好。预处理方法1：根长至1.5-2cm长时切取1.5mm 左右的根尖，饱和a-溴萘约25处理2-3小时，水稻一般不预处理。方法2：根长好后将种子置于4冰箱处理一个晚上，第二天在25下恢复2-3h，也可得到许多分裂相。NOTE：何进取根尖最好具随机性，与季节以及细胞分裂时期很有关系。（玉米8:00AM，水稻11:00-12:00AM）水 洗 反复几次前低渗 ddH2O或0.075M KCl（0.6KCl溶于100ml ddH2O）低渗30min（室温）。固 定 新鲜31甲醇冰乙酸固定2-3小时或4过夜。NOTE：一定要用新鲜固定液；如果用于石蜡切片组化显色，甲醇固定的材料会导致很高背景，应换用4%多聚甲醛。水 洗 反复几次，洗净。酶 解 2%纤维素酶+2%果胶酶混合（11），28下处理3小时左右。NOTE：酶解是最至关重要的一步，首先是酶的质量，很多酶都可导致分裂相少，以SERVA公司的果胶酶为最好，根据材料不同，酶解时间会有所变化。洗载片 载片一定要干净，以防材料脱落和保持清洁的背景。洗片步骤：1）IN HCl中3min以上2）自来水洗（每片单独漂洗）接着用双蒸水洗3）95%酒精浸泡30min以上（每片单独放入）制 片 小心吸去酶液，水洗几次，吸取1-2个根尖于干净的干载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，滴2-3滴固定液使材料分散，火烤至着火。NOTE：敲得越碎越好，敲至固定液干后，再滴固定液，迅速涂开，火焰干燥，干燥后肉眼观察应为规则干净的小雨点状，若小雨点上像有一层不透明的薄层，说明酶解时间不够。镜 检 检后将符合要求的制片储存于-20下备用。NOTE：每张制片上至少应有150个左右分散良好但背景干净的分裂相方可用于杂交。REFERENCES第2节 质粒的转化与扩增若寄来的探针是插在质粒中cDNA克隆或基因片段，首先要对其进行转化，一般利用E.Coli 作为载体，转化的关键在于如何制备感受态的 E.Coli细胞，本实验利用 CaCl2来制备感受态细胞，此方法简便、快速。试 剂：LB培养基，0.1M Cacl2，70%甘油实验步骤：感受态E.Coli的制备从-20下取2-5l E.Coli，涂在平板上，37培养16-20h。挑取单个菌落于20ml已预热至37的LB培养基(不含Amp)中，37，300rpm剧烈振摇约3h。培养物转移至4支预冷的5ml Eppendorf管,冰上放10min，4000rpm离心 3-5min，回收细胞（4）； 倒出培养液，倒置lmin。以5ml预冷的0.1M Cacl2重悬每份沉淀，冰浴30min。4000rpm离心5min（4）；倒出培养液，倒置lmin。每管加预冷的0.1MCaCl2 0.25ml，重悬细胞，冰浴lh每管100l分装,保存于-20下,长期保存转化效率会有所下降。质粒DNA的转化取-20保存的感受态细胞二支，冰上溶解10min，一支加质粒cDNA(10l，lkb的探针，建议采用切口平移法；随机引物法标记效率比切口平移高，更适合于100bp-lkb探针的标记；而对于100bp的探针，则需要用末端标记法；但如果你手头的探针量很少（少至50ng），相应引物的话，PCR是最佳选择，简便快速，可制备大至4kb的探针。实验步骤4.1 切口平移标记法(Biotin)本实验室用于中期染色体原杂交的探针一般用生物标记。依次加入下列试剂于1.5ml Eppendorf管中：探针数123终浓度(50ul中)dNTP10203030uM of each10Buff510151Bio-11-dUTP481230uMddH2O265278DNase(0.75ng/ul)2.557.51.88ngDNA Pol.12U(2.5ul)24U36U12U质粒DNA(0.4ug/ul) 取上述混合液45ul，加相应探针5ul1.52ug15下反应2.5 h, 加5ul终止液(Stop solution)终止。NOTEDNA Pol.的量应参照各厂家提供的浓度，以每50ul标记液中含12U为准。原位杂交探针的合适长度为300600bp，照此系统标记中DNase用量，一般可达到这一目的；若为NT试剂盒，其提供的浓度应已考虑这一参数，因此酶量应已优化。现在标记一般用华美公司试剂盒包括10Buffer、消毒三蒸水、dNTP、stop solution（0.5M EDTA）。4.2 纯化已标记的探针：制作柱子 在0.5ml微Eppendorf管底部用青霉素皮试探头刺孔，将少量硅化玻璃丝加在底部，套入去底的1.5ml微Eppendorf管中，再置于15ml培养管中，加入750l Sepharose CL-6B于穿孔微Eppendorf管中，25,00rpm离心5mim。用另一新1.5ml微Eppcndorf管更换，贴上Prode标签。在作好的新鲜柱子上，立即加入已标记的Probe（注意柱子一定要当作当用），25,00离心10mim。测定纯化后Probe的体积，储存于-20下备用。4.3其它探针标记方法：用于多色FISH或Fiver-FISH，除用生物素标记外，至少还要用到另一种标记物，一般也为地高辛（Digoxigenin / Digoxin，DIG）；而用于Southern Blotting时，则一般用同位素（Isotope）标记，也可用DIG标记。介绍两种试剂盒的标记方法（试剂盒上有）DNase/ DNA Pol介导的切口平移标记法(32P) (Nick Translation Labeling Kit，Promega) Klenow介导的随机引物标记法(DIG)(DIG Labeling and Detection Kit，B.M.) 反应体系（50ul）反应体系（50ul）dNTP（dATP,dTTP, dGTP）10Buff回收的Probe（不含载体）ddH2ODNase/ DNA Pol32P-dCTP（最后加）10ul5ul5ul（约1ug）21ul5ul4uldNTP（dATP,dTTP, dGTP）10Buff回收的Probe（不含载体）6mer Primers（0.09U/ul）ddH2ODNase/ DNA Pol32P-dCTP（最后加）10ul5ul5ul（约1ug） 3ul21ul5ul2ul（5U）15下反应1.5 h, Stop solution终止37下反应1.5 h, Stop solution终止NOTE 应用于Southern Blotting的探针应为不含质粒载体的插入片段，因此应先用相应的限制性酶进行酶切，而后用低熔点琼脂糖对探针进行回收。 相比之下，PCR标记的优点是只须极少量（50ng）的插入片段（模板）便可扩增出大量高效标记的探针（Friedman, 1990），并且一般直接可用少量细菌裂解液做模板。缺点是必须要有目的插入片段的特异性引物和相应的仪器设备，并且，人们总是发现一些克隆，它们不能用这种方法扩增，原因不明。探针标记用溶液配制20生物素稀释液 10ml成 分用 量工作浓度1M Tris-7.50.5M EDTAddH2O1ml2ul9ml5mM5uM NOTE: 每管1ml分装，-20保存。使用时稀释20倍。 Bio-11-dUTP购进时一般为储存浓度10mM（如果为固体，则0.1mg溶于11.6ul稀释液中）。分装成1ul/管储存，用时每管加入19ul稀释液稀释成工作浓度0.5mM。稀释后的Bio-11-dUTP不适合长期保存，反复冻溶5次后将影响标记效果。DNase稀释液=10SA-HRP稀释液DNase贮存液（1mg/ml） 10ml成 分用 量贮存液中浓度1M Tris-7.5甘油1M MgCl2ddH2ODNase200 ul5.0ml10ul4.8ml1.0mg20mM50%10mM1mg/ml NOTE：此贮存液要先用DNase稀释液按以下方法稀释。DNase稀释贮存液（0.75ng/ul） 取1mg/ml DNase贮存液2ul，加入198ul ddH2O，振荡混匀，取混匀后的液体3ul，加入7ul DNase稀释液，振荡混匀；再取混匀后的液体5ul，加入15ul DNase稀释液，振荡混匀，每管0.5ml分装，-20保存。第5 节 点印渍检测标记效果（NBT/BCIP显色程序）基本知识 检测和定位抗原一般是通过抗原-抗体反应完成。在通用的二级抗体上连接荧光分子或酶，便可进行荧光装置直接检测或经酶底物显色后间接检测。后者称酶联免疫显色反应（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA），在许多领域都占有重要应用。常用的酶是辣根过氧化物酶horseradish peroxidase（HRP），常通过底物DAB来显色；另一种是碱性磷酸酶alkaline phosphatase（AP），通过底物NBT/BCIP来显色（Ruzen，1995）（如下图）应 用 检测探针标记效果；检测ISH信号；基因表达原位分析（切片上的mRNA定位；蛋白质定位）；检测细胞凋亡中DNA特异片段化；DIG或Biotin标记的Southern Blotting，Western Blotting；ELISA实验步骤：生物素标记的探针DIG标记的探针（详见KIT，B.M.）点膜1ul Probe点于2cm3cm硝酸纤维上，同时点对照烤膜80下20min封阻55-60下在小培养皿Buffer中用摇床摇30min（60以上BSA会变性）洗膜Buffer洗膜2min（5ml Eppendorf管）偶联偶联SA-AP溶液5ml（SA-AP 2.5ul，Buf5ml ），37摇床，30min（黑色5ml dorf 管）0.05M Tris-7.5中以15000稀释抗DIG-AP(B.M.),并以此代替SA-AP溶液。洗膜Buffer2min，Buffer 2min（5ml Eppendorf管）显色加显色液（NBT/BCIP），20（或37）下10min（黑色5ml dorf 管）烘膜80 10min，然后贴在记录本上第6 节 CTAB法提取植物总DNA第 2 章 中期染色体原位杂交引 言 通过原位杂交（in situ hybridization ISH）对特异DNA序列在植物染色体上进行物理定位，现在在植物分子生物学的许多领域变得日益重要。ISH可以给人们提供基因或DNA序列在染色体上的真实物理位置和次序信息（Heslop-Harrison，1992；Leitch，1994； Bennett，1995）。有助于通过染色体步查分离目的基因的研究，也可使人们对物理图谱和遗传图谱进行比较（Gustafson，1990；Pedersen，1995），架起了两者之间的一座桥梁（de Jong，1999）ISH在方法上也逐步形成了从繁琐到简单、从放射性标记到非放射性标记、从DAB检测向荧光（FISH）再向多色荧光检测、从常规杂交向原位PCR以及Fiber-FISH的发展格局，灵敏度和分辨率正在由Mb向kb、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、大片段向小片段再向BAC/YAC的方向迈进。DNA原位杂交的载体有以下几种：间期（interphase）染色质；减数分裂粗线期（pachytene）染色体；中期（metaphase）染色体；DNA纤维（DNA Fiber）。应 用 基因定位 分析DNA序列位置与基因组高级结构、基因活性及遗传重组之间的关系 转基因植物的确定、鉴定基因插入位点 鉴定外源渗入染色体片段（GISH） 基因克隆（Fiber-FISH）物种间的亲缘关系多倍体形成研究第1 节 原位杂交NOTES本章介绍的是生物素标记探针的原位杂交程序整个操作中，除非特别指明，应注意保持载玻片湿润除非特别指明，均应在20-25下操作。一、所需试剂及仪器：水浴锅 、温箱、烘箱；70、95、100 EtOH，去离子甲酰胺，2SSC，20SSC，RnaseA， SDS（10%），Probe。二、实验步骤：简单描述为：制片 干燥 RNaseA处理 变性 脱水 探针变性 杂交1、设置37，70水浴锅，37温箱，60烘箱梯度乙醇脱水染缸（各50ml）：染缸1：70% EtOH 染缸2：95% EtOH （保存在-20下）染缸3：100% EtOH2、干 燥：在60烘箱中烤一小时或在室温下干燥。前者有助于染色体在载玻片上固定，更难脱落。但就是在空气中干燥，染色体一般也不会脱落。3、准备变性染缸：染缸4：35ml 去离子甲酰胺（不灭菌） 在70水浴中保温染缸5：15ml 2SSC，加盖Note：此时不能把两种溶液混在一起预热，染色缸随水浴锅一起升温，否则易引起染色缸破裂4、准备RNaseA溶液（1g/ml）染缸：染缸6： 原液 5l（10mg/ml） 37水浴保温 2SSC 50ml （灭菌）5、RNase A处理，37一小时。Note：也可直接吸取RNaseA溶液50l左右，用干净盖玻片盖好，保温皿内37保温1h。6、敲一盒冰，取出-20下配制杂交液的药品，冻融后配制杂交液片子数（不同探针）1 2 3 4 5 6 终浓度FAD（Sigma）（100%）硫酸葡聚糖（50%）20SSCSDS（10%）sssDNA（华美，10mg/ml）25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.010.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.05.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.02.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 50% 10% 2SSC 0.5% 0.2%Probe每张片子取混匀溶液43l，加相应probe 7l（30-40ng/l，计载体），混匀，短暂离心，置于冰上5 ng/l（不计载体）NOTES:所有药品应始终放在冰上配制好的杂交混和液可在-20下保存6个月SDS是一种湿润剂，可帮助探针穿透进入，使用浓度一般为0.051.07、配制70 FAD：在RnaseA处理完成前，将在70下的去离子甲酰胺加入热的2SSC中继续保温。（70l FAD30l 2SSC/片，70烘箱）8、变性：RNase A处理完后，片子在70 70 FAD中处理3.5 min。9、脱水（-20）：取出后立即放入 -20 70乙醇 -20，95乙醇， -20，100乙醇，中，5 min 5 min 5 min10、制片