实验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白.doc

教案首页第_3_次课 授课时间：2006年11月13日11月17日课程名称生物化学与分子生物学实验课年级2005专业、层次临床医学本科授课教师符伟玉职称讲师课 型(大、小)小学时3授课题目（章、节）实验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白基本教材或主要参考书自编 生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求：1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，了解其操作方法。2、了解血清脂蛋白各组分的分离情况。大体内容与时间安排，教学方法：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 5min2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤及示范 10min3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意事项 5min4、学生做实验 140min教学方法：实验+示教教学重点、难点：重点：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤难点：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理2、实验操作中的灌胶和点样教研室审阅意见：教研室主任签名：年 月 日基本内容辅助手段和时间分配一、实验原理（一）浓缩效应在pH=6.7的浓缩胶中带电粒子的泳动速度为: Cl- proteinGly，蛋白质样品夹在Cl-和Gly之间被挤压成一条狭窄的区带,使蛋白质样品浓缩。（二）电荷效应不同蛋白质pI不同，在相同pH值下所带电荷不同，因此在相同电场强度作用下，在电场中的移动（泳动）速度不同，可以根据这一效应把蛋白质分成不同的区带。（三）分子筛效应所聚合形成的PAG为多孔网状结构，对大分子物质的穿透有一定阻力，蛋白质在通过具有均一孔径的凝胶时，因颗粒大小不同，形状规则程度不同，所受阻力也不相同。利用本效应也可以将蛋白质分离为不同的区带。颗粒大形状不规则的分子阻力 电泳v 颗粒小, 球形分子阻力 电泳v 将血清脂蛋白用苏丹黑B丙二醇预染，加于聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，因此它的分辨率高，可将血清脂蛋白各组分清晰分开。二、操作步骤（改动）1、第1步改为：将清洁的0.57.5cm玻璃管（1支/2人），一端套上带有玻璃珠的橡皮管（同时滴入2滴蔗糖并检查有无漏水）垂直插在小试管上，以备制胶。从冰箱中取出下列试剂，在室温中平衡，然后在一小烧杯中依此加入。2、第2步：迅速用吸管吸取上述混合液沿管柱注入玻管中，每管0.8ml-1.0ml，随即用滴管经针头沿管壁缓慢加入蒸馏水约0.5cm高度以隔氧；改为迅速用吸管吸取上述混合液沿管壁柱注入玻管中至离管口1cm，加满蒸馏水以隔氧。3、第3步然后取预染血清50l加在凝胶面上，再沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端，改为沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端，用200l枪取预染血清50l加在凝胶面上；删除取血清0.2ml，加苏丹黑B丙二醇液0.02ml，加25%蔗糖溶液0.02ml，混匀，室温放置45min后, 2000r/min离心5min。4、第4步，电流为25mA/管，待第一色带到达胶管下段约1cm时停止电泳；改为电流为6mA/管，待第一色带到达胶管下段约2cm时停止电泳。三、注意事项1、丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂，过硫酸铵为有毒成份，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触（漏胶时不要用手接触）。大量操作时应在通风橱中进行。2、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内(4)保存。可贮存12月。测定pH值(4.95.2)可检查其是否失效。失效液不能聚合。3、TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。4、配胶取样要准确，最后加过硫酸铵，加完后轻轻混合（关键）；5、配好胶后应于尽快灌胶（不要形成气泡），5分钟内完成装柱，清洗仪器；6、切记装柱后立即用蒸馏水封闭；灌胶和电泳时要注意排除气泡；7、加样时注意不能损伤已聚合的凝胶表面；8、电泳时凝胶管不能漏水,并且与电泳槽垂直；凝胶和滤纸请放入垃圾桶中，勿直接倒入水池9、电泳时间不能过久，待第一条色带到达玻璃管下端约2cm时停止电泳，否则色带会变宽。5min示意图 示意图示意图10min5min实验+示教140min 小 结实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高。兔血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出34个组份。复习思考题、作业题1、正常空腹血清脂蛋白电泳可出现哪些区带？将本实验的电泳图谱