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分子生物学复习 张玉蕾 水产0703 2020-1-16分子生物学复习第1页 共8页第二章 核酸的结构1、基本概念：增色效应、减色效应、回文结构、DNA的一结构级、二级结构DNA变性（DNA Denaturation）：双螺旋DNA溶解成单链的现象，也称溶解。DNA复性（DNA Renaturation）：变性DNA在一定条件下重新恢复双链的过程，也称退火（Anneal）。增色效应：在DNA的变性过程中，紫外吸收（260 nm）值增大减色效应：在DNA的复性过程中，紫外吸收（260 nm）值减小回文序列（inverted repeat，palindrome sequence）（反向重复）：指在双链DNA中某些区段含有两个结构相同、但方向相反的序列。DNA的一结构级：DNA分子中核苷酸的排列顺序DNA的二级结构：两条单链DNA通过碱基互补配对的原则形成的双螺旋结构。2、分子杂交：亲缘关系相近的不同来源DNA单链或DNA单链与RNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程称为分子杂交。1）Southern杂交（Southern Blotting）：DNA + DNA将DNA固定在滤膜上，用标记好的同位素DNA探针与之杂交，通过放射自显影显示与探针互补的区带，识别特异序列。2）Northern杂交：RNA + DNA研究对象是mRNA，探针一般是DNA。将RNA固定在滤膜上，用DNA探针与之杂交。3）Western杂交：蛋白质蛋白质抗原与抗体的杂交，研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。4）原位杂交（in situ bloting）利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术 3、影响DNA变性、复性的因素 影响DNA变性的因素：Tm（melting temperature）：使DNA双螺旋结构解开一半的链时的温度。影响 Tm值的因素1）在 A，T，C，G 随机分布的情况下，GC%愈高Tm值愈大2）GC%含量相同的情况下，AT形成变性核心，变性加快，Tm值小3）片段的长度大片段D.S.DNA分子之间比较：片段长短对Tm值的影响较小，与组成和排列相关小于100bp的D.S DNA分子比较：片段愈短，变性愈快，Tm值愈小4）变性剂（如尿素，酰胺等）尿素，酰胺与碱基间形成氢键改变碱基对间的氢键Tm值可降至40左右5）介质中的离子强度：离子强度高，Tm高6）极端pH条件的影响：一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素，均将使Tm值降低 影响DNA复性的因素复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞1）阳离子浓度：0.18 0.2M Na+ 可消除poly dNt间的静电斥力2）温度：复性反应的温度 Tm253）S.S.DNA分子的长度S.S.DNA愈长分子扩散愈慢复性愈慢S.S.DNA愈短分子扩散愈快复性愈快4）S.S.DNA 的初始浓度5）DNA分子中，dNt的排列状况（随机排列，重复排列）第三章 基因与基因组的结构1、基本概念：重叠基因、割裂基因、内含子、外显子、假基因、跳跃基因、C值矛盾、持家基因、奢侈基因、选择性剪接、微卫星DNA重叠基因（overlapping gene）：共同使用同一DNA序列，但编码两种不同蛋白质的基因。C值矛盾：每个物种单倍体基因组总DNA的含量称为最大C值，编码基因信息的总DNA含量称为最小C值；a生物体进化程度高低与大C值不成明显相关（非线性）；b亲缘关系相近的生物大C值相差较大；c一种生物内大C值与小c值相差极大微卫星DNA（microsatellite DNA）：由2-6个bp单位组成的串联重复序列，分散于整个核基因组。如TGTGTG =（TG）n持家基因（house keeping gene）：在不同种类的细胞中均表达，功能对于每个细胞都必需；占基因总数90奢侈基因（luxury gene）：仅在特定的细胞类型中表达；占基因总数10假基因（pseudo gene）：核苷酸序列与编码某一蛋白质的基因相似，但不具功能，不能转录形成成熟mRNA或不能翻译出功能蛋白质。跳跃基因（jumping gene）从基因组上的一个位置转移到同一条染色体或另一条染色体的另一个位置，引起相应控制性状的改变。外显子（exon）：编码的DNA序列，即被表达的DNA区段。内含子（intron）：不编码的DNA序列。割裂基因（Split Genes）：DNA和mRNA之间形成特殊的RNA-DNA异源双链分子结构。选择性剪接：同一区段DNA序列可以加工生成两条或两条以上的链。2、原核生物、真核生物基因组的特点；线粒体基因组的特点（了解）原核生物基因组的特点：1）基因组较小，编码区和非编码区组成，非编码DNA比例较少，无内含子；2）有操纵子结构， 且为多顺反子；3）结构基因多为单拷贝，rRNA基因多拷贝；4）有些基因之间可以形成重叠基因； 真核生物基因组的特点：1）基因组较大，结构复杂，大部分位于细胞核中，为双链线状，并与蛋白质结合形成染色质，而且染色体数目往往不是一条，而是多条；2）每条染色体的DNA分子具有多个复制起点，基因内存在内含子，真核基因多为断裂基因；3）编码序列仅占基因组DNA的一小部分，绝大多数为非编码序列；4）基因组中存在大量的重复序列，重复序列在人基因组中约占50；5）转录产物为单顺反子mRNA，即一mRNA只能翻译成一种蛋白质。 线粒体DNA基因组的特点（了解）：1）分子结构简单；2）mt-DNA的相对分子量低；3）进化速度快（mt-DNA结构基因）4）无组织特异性5）核苷酸组成不均一。第四章 DNA复制1、DNA复制的特点1）半保留复制；2）半不连续复制2、DNA复制的方式（复制叉复制、形复制、滚环复制、D形复制）a、新起始方式（de novo initiation）或复制叉式（replication fork）线状DNA：复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点。环状DNA：型复制：从复制起点开始，双向同时进行，形成样中间物；复制可以是双向或单向进行，多数为等速双向复制。b、滚环式复制（rolling circle replication）由于复制时产生的滚环结构形状象，又称复制。如病毒、细菌因子c、D环复制（D-loop replication）特点：复制起点不在双链DNA同一位点。如线粒体或叶绿体DNA的复制方式3、线状 DNA的复制及避免5末端短缩的模式1）T7噬菌体T7 DNA两端的DNA序列区约有100bp长的序列完全相同（正向重复）。而且在T7 DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7 DNA长度，而是许多单位长度的T7 DNA首尾连接在一起。T7 DNA两个子代DNA分子都会有一个3 端单链尾巴，两个子代DNA的3 端尾巴以互补结合形成两个单位T7 DNA的现性连接。然后由DNA聚合酶填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7 DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7 DNA分子。这样的T7 DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7 DNA分子。2） 腺病毒DNA复制腺病毒DNA两端为反向重复序列，首先末端前体蛋白与ser和dCTP结合形成复制起始复合体，由dCMP提供3 OH引发复制。3） 真核生物端粒首先端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶中的RNA与突出的3 引物配对；以RNA为模板，在DNA3 端从头合成DNA；延伸6个nt；合成一个重复单位后，端粒酶向DNA模板新合成的3 端移动，引物再和模板配对，就这样循环往复周而复始，最后产生端粒。4、引起DNA损伤的机制1）DNA复制产生的损伤a、复制中的碱基错配；b、碱基的互变异构移位（tautomeric shift）；c、DNA聚合酶的“打滑”；d、碱基的脱氨基作用（deamination）；e、碱基丢失2）物理因素引起的DNA损伤a、紫外线引起b、电辐射引起3）化学因素引起的DNA损伤a、烷化剂对DNA的损伤b、碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤4）嵌入染料：结果产生移框突变5、DNA修复（repair）机制 1）直接修复（direct repair）：光修复（light repair）紫外线损伤：DNA链两个相邻嘧啶间以共价键相连形成嘧啶二聚体。修复机制：在可见光（300600nm）活化之下，由光复活酶（photoreactivating enzyme，PR）催化胸腺嘧啶二聚体分解为单体。2）切除修复（excision repair）：是一种广泛存在的修复机制，由多种酶参与，可适用于多种DNA损伤的修复。基本过程：将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。方式：碱基切除修复和核苷酸切除修复3）重组修复（recombination repair）：复制起始时尚未修复的DNA损伤部位先复制再修复，也称为复制后修复。复制时由于复制酶系统在损伤部位不能通过碱基配对合成子链，因此复制出的子链出现一空缺。4）SOS修复SOS反应：细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急状态下，为求生存而出现的应急反应。修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-prone repair）5）错配修复系统（Mismatch repair system）a识别错配的碱基对；b对错配的一对碱基要能准确区别哪一个是错的，哪一个是对的；c切除错误的碱基，并进行修复合成。第五章 RNA转录1、转录（transcription）：是指以DNA为模板，在RNA聚合酶催化下，以4种NTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA 的过程。2、转录的特点1）转录的不对称性a以双链DNA中的一条单链作为转录模板（杂交实验所证实）b用于转录的DNA链为模板链（template strand），也称反义链（anti-sense strand）c不作模板的链为编码链（coding strand），也称有义链（sense strand）d有义链与反义链并非固定不变。2）转录的连续性且不需要引物3）转录的单向性：RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为35，而RNA链的合成方向为53。 4）有特定的起始和终止位点3、转录与复制的不同点区别转录复制模板模板链转录（不对称转录）两条链均复制原料NTPdNTP酶RNA聚合酶DNA聚合酶产物mRNA，tRNA， rRNA子代双链DNA（半保留）3OH（引物）不需要需要连续性连续片段配对A-U，G-CA-T，G-C4、增强子（enhancer）：能使基因转录频率明显增加的DNA序列。特点：1）增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍。2）增强效应与其位置和取向无关3）增强效应有严格的组织和细胞特异性4）没有基因专一性，可在不同基因组合上表现增强效应5）没有生物种属的特异性，其作用受到细胞发育和分化的影响6）许多增强子还受外部信号的调控7）增强子要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没有严格的专一性。5、原核生物转录如何终止？（真核生物了解） 不依赖因子的终止子终止转录在终止回文序列处转录出来的RNA形成发卡结构,这种结构与RNA聚合酶结合，阻碍了RNA链从三元复合体中进一步向外释放，因而造成转录作用的高度延宕。GC含量越高，延拓时间越长，单靠发卡结构并不足以使转录终止，还需要模板上回文序列后面的富含A/U序列，在转录出若干个U后，由于A和U之间的氢键和碱基堆积力很弱，RNA和DNA杂交部分很容易拆开，RNA聚合酶从RNA链上解离下来，转录的终止。 依赖因子的终止子终止转录（1）通读（read through）：在依赖因子的转录终止过程中，RNApol转录了IR序列之后，虽发生一定时间的延拓，但如果没有因子存在，则RNApol会继续转录。（2）因子对终止子的作用因子结合在合成的RNA链5 端利用水解ATP放出的能量，因子沿RNA从53移动，而RNA聚合酶在终止子处的较长时间的延拓给因子追赶的机会因子与聚合酶相互作用而造成转录的终止，聚合酶和因子从核酸分子上释放出来。第六章 转录后加工1、真核生物tRNA的加工 真核生物tRNA前体及其加工的特点：真核tRNA的基因与原核不同：a真核的前体分子 tRNA数目多、单顺反子、成簇排列、有基因间隔区；b真核的tRNA前体中含有内含子；（位于反密码子环下游、长度和序列各异、内含子外显子交界处无保守序列、剪接有RNase参与、内含子与反密码子配对）c其加工过程要剪接内含子，都要加CCA 加工过程a剪接：去除初级产物中5端和3端的序列；剪接内含子序列b加CCA-OH 3末端c修饰：甲基化；还原；核苷内的转位；脱氨2、真核生物mRNA的加工mRNA前体加帽子、加尾巴、剪接、甲基化、编辑成熟mRNApre-mRNAcapping、tailing、splicing 、methylation、editingmature mRNA 1）加帽2）3末端的加尾过程：在前体mRNA的3端距加尾信号（AAUAAA）约20nt处加上20-200个polyA的过程3）mRNA的内部甲基化4）核mRNA前体的剪接（Splicing）5）RNA编辑（editing）：指遗传信息在mRNA水平上发生改变的过程。即RNA的编码序列与转录产生它的DNA序列不同，转录后的RNA在编码区发生碱基的加入，丢失或转换等现象。编辑在指导RNA（guide RNA，gRNA）作用下完成 gRNA的3OH攻击mRNA：产生5段3段（5端与gRNA3相连） 5段的3-OH攻击gRNA的U-U：生成RNA编辑产物（插入一个U），gRNA（少一个U）（插入U的两步转酯反应）第七章 蛋白质的合成1、基本概念遗传密码：DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系称为遗传密码。密码子（codon）：mRNA上每3个相邻的核苷酸编码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或三联体密码（triplet codon）开放读码框：从mRNA5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放读码框（open reading frame， ORF）。2、遗传密码的基本特征1）连续性编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。如插入或缺失一碱基，可造成移码突变。2）密码子的简并性 同一个氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称密码子的简并性（degeneracy）。 对应于同一种氨基酸的不同密码子称同义密码子（synonymous codon）。 大多数简并性表现在密码子的第三个核苷酸上，即第一、二个核苷酸确定后，第三个核苷酸可变。3）摆动性（wobble）转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。 4）密码子的偏爱性（codon usage bias） 同一物种中，编码同一氨基酸的密码子的使用频率不同。 不同物种间（原核和真核生物），编码同一氨基酸的密码子的使用频率也不同。 密码子的使用频率与tRNA的数量有关5）通用性和变异性 蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 动物细胞的线粒体DNA（mtDNA）、支原体及少数纤毛类原生动物的编码方式与通用密码子有所不同。3、蛋白质合成原料mRNA、tRNA、rRNA、酶、蛋白质因子、ATP、GTP、核糖体4、蛋白质的合成步骤，原核生物、真核生物蛋白质合成的异同点a氨基酸的活化；b肽链合成的起始；c肽链的延伸；d肽链合成的终止与释放 真核细胞蛋白质合成的特点a核糖体为80S，由60S的大亚基和40S的小亚基组成b起始密码AUGc起始tRNA为MettRNAiMetd起始复合物结合在mRNA 5端AUG上游的帽子结构，真核mRNA无富含嘌呤的SD序列（除某些病毒mRNA外） e由多种起始因子参与（ eIF1， eIF2， eIF3等十多种 ）f真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落g肽链延伸因子（EF1， EF2）及释放因子（RF可识别3种终止子） 真核生物细胞成熟mRNA的形成过程 内含子：不能编码蛋白质的核苷酸片段 外显子：编码蛋白质的核苷酸片段 转录后新合成的mRNA是未成熟的mRNA，需要在特定部位剪接，最后形成较短的有功能的RNA 原核生物中，DNA链上不存在内含子第八章 原核生物基因表达调控1、基本概念基因表达（gene expression）：指基因转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。操纵子（operon）：原核生物基因表达和调控的一个完整单元，包括调节基因、启动子、结构基因和操纵基因。顺式作用元件（cis-acting elements）：调节基因表达的DNA序列。反式作用因子（trans-acting factors）：调节基因表达的蛋白质因子。衰减子（attenuator）：一段位于结构基因上游前导区具有终止子结构的短序列，通过前导序列转录产生的 mRNA 形成类似于终止子的二级结构，达到转录终止的目的。严谨反应（stringent response）：原核生物在氨基酸饥饿状态下，自动停止或降低（10-20倍）rRNA， tRNA转录，从而调节蛋白质合成速率的严谨现象2、乳糖操纵子调控机制1）lac的结构2）lac的调控机制a、阻遏蛋白的负性调控：当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵元处于阻遏状态。当有乳糖存在时，乳糖受-半乳糖苷酶的催化转变为半乳糖，与阻遏蛋白结合，是阻遏蛋白构象变化，失去与操纵基因的亲和力，与操纵基因解离，基因转录开放。b、CAP的正性调控：由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。无乳糖时有乳糖时无葡萄糖cAMP浓度高Lac阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不发挥作用Lac阻遏蛋白不封闭转录，CAP+ cAMP加强转录。有葡萄糖cAMP浓度低Lac阻遏蛋白不封闭转录时，没有CAP存在，也无高效转录活性。3、色氨酸操纵子（tryptohane operon，trp）调控机制trp操纵子属阻遏型操纵子，主要调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶的转录合成。 a、当色氨酸浓度高时Trp-tRNATrp存在核糖体通过片段1（2个Trp密码子）封闭片段2片段3，4形成发夹结构类似于不依赖因子的转录终止序列RNA聚合酶停止转录，产生衰减子转录产物转录、翻译偶联，产生前导肽b、当色氨酸浓度低时Trp-tRNATrp 没有供应核糖体翻译停止在片段1（2个Trp密码子）片段2，3形成发夹结构转录不终止RNA聚合酶继续转录第九章 真核生物基因表达调控1、基本概念启动子（promoter）：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。增强子（enhancer）：能使基因转录频率明显增加的DNA序列。沉默子（Silencer）：某些基因含有负性调节元件沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。锌指结构（zinc finger，ZF）：一个蛋白质结构域，长约30个aa，其中4个氨基酸（4个Cys或2个Cys，2个His）与一个Zinc原子相结合，形成一个四面体结构。与Zinc结合后锌指结构较稳定。与DNA双螺旋大沟结合。2、真核生物从哪些方面对基因的表达进行调控？1）DNA水平：基因丢失、基因扩增、基因重排、甲基化修饰、染色质的结构状态2）RNA水平：转录水平调控【顺式作用元件（cis-acting element）：包括启动子、增强子和沉默子等；反式作用元件（trans-acting element）：激活因子、阻遏因子等】、RNA的转录后加工、mRNA转运、mRNA稳定性3）蛋白质水平：翻译过程、翻译后加工、蛋白质的稳定性3、甲基化引起哪些生物学效应？（基因印记、亲本印记）X染色体失活、亲本印迹、肿瘤发生、个体发育 基因组印迹是两个亲本等位基因的差异性甲基化造成了一个亲本等位基因的沉默，另一个亲本等位基因保持单等位基因活性 肿瘤发生：抑癌基因甲基化不表达4、小RNA干扰调控 RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指当细胞中导入与内源性mRNA同源的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。 RNA干扰的作用机制 长片段dsRNA在细胞内被Dicer酶切成长度大约为19-23nt的小片段干扰 RNA （small interfering RNA，siRNA），由siRNA参与构成复合物RISC（RNA-induced silence complex）。siRNA通过与同源mRNA的特异配对，引导RISC特异地降解同源mRNA，导致基因表达的抑制。因此小片段的siRNA也可以诱导高效的基因沉默。第十章 基因工程1、基因克隆（流程）上游：获得目的基因、构造重组DNA分子、转化或转染下游：表达、蛋白质产物的分离纯化2、受体细胞的选择 限制性内切酶缺陷型防止降解 DNA重组缺陷型避免重组 遗传互补型有利于筛选转化亲和型较高的可转化性3、克隆基因的鉴定（蓝白斑筛选）重组子的筛选与鉴定蓝白筛选（互补的检测）4、基因组文库 基因组文库（genomic library）：指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的克隆子总和。 特点：提供全套遗传信息，即完整的基因组DNA，可以研究基因组中5端控制基因转录的调控序列，内含子的分布和作用，以及重复序列的数量分布及大小。 构建流程：抽提基因组DNA制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法等）5、PCR 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）：利用DNA片段旁侧两个短的