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光谱法研究头孢唑啉钠和头孢呋辛与木瓜酶的作用机制姓名：卫国强 指导老师：席小莉摘要 利用荧光光谱和紫外光谱研究了头孢唑啉钠和头孢呋辛钠与木瓜蛋白酶之间的相互作用，求得了不同温度下的结合常数K。.研究结果表明，静态猝灭是导致头孢唑啉钠和头孢呋辛钠对木瓜蛋白酶荧光猝灭的主要原因。通过计算热力学参数，确定了二者与木瓜酶之间相互作用力的类型。同时，根据Forster非辐射能量转移理论求出给体-受体之间的结合距离和能量转移效率。关键词 木瓜蛋白酶；唑啉钠；呋辛钠；荧光光谱；紫外吸收光谱；Mechanism of Molecular Interaction between andPapain: Spectroscopic InvestigationsAbstract The interaction between cefazoline,cefuroxime and papain was investigated by fluorescence spectroscopy and UV-Vis absorption spectroscopy ,and the binding constants K were obtained at different temperatures. The experimental results suggested that static quenching was the main reason for the fluorescence quenching process. The thermodynamic data obtained showed the kinds of predominant intermolecular forces between them. According to the Forster theory of nonradiation energy transfer,We calculate the bilding distance between the offer and the accepter and the effiency of the energy transfer.Keywords papain; cefazoline,cefuroxime; fluorescence spectroscopy; UV-Vis absorption spectroscopy;蛋白质是一类重要的生命物质，担负着生命活动过程中多种极其重要的功，目前，利用光谱法的研究主要针对血清白蛋白,这是因为血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，具有储运内源性代谢产物和外源性药物小分子等重要生理功能1-4。木瓜蛋白酶简称木瓜酶，它是一种含巯基肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，它能把蛋白水解物合成为类蛋白质，由于其具有纯天然、无毒无害、使用安全等功能特性，而被广泛用于食品、美容化妆品、医药保健品、日化品、饲料、皮革、纺织品等行业5，但目前对它的研究还很少。 头孢唑啉钠和头孢呋辛钠是抗菌类药物的一种, 最近十多年来, 已迅速发展成为一类广泛应用于临床的一线抗感染药物, 它具有临床疗效好、不良反应少、可达到较高的治愈率等特点，因此，研究二者与木瓜酶的作用机制在医学上有重要的意义。1 实验部分1.1 仪器与试剂荧光光度计（美国Varian公司）；紫外分光光度计（日本岛津UV-265型）木瓜酶（分子量21000）配置成110-6mol/L 溶液；头孢唑啉钠和头孢呋辛钠（海口奇力制药有限公司）配置成浓度为110-3mol/L溶液；pH为7.4的Tris-HCL缓冲液1.2 唑啉钠和呋辛钠与木瓜蛋白酶作用的荧光光谱测定加2ml木瓜酶于荧光池中，设定激发波长为275nm，激发与发射狭缝为10nm，在288K下每次加2ul唑啉钠，扫描280-500nm的荧光发射光谱，在298K和303K下重复上述实验。同理，在288K，298K和310K下将呋辛钠加入木瓜酶再扫描荧光发射光谱。1.3 唑啉钠和呋辛钠与木瓜酶的紫外光谱测定设定温度为298K，用Tris-HCL缓冲液扣空白，加2ml木瓜酶于紫外池中，扫描其在200-800nm的紫外吸收，然后每次加入1ul唑啉钠或呋辛钠，扫描紫外吸收光谱。1.4 唑啉钠和呋辛钠与木瓜酶作用的同步荧光光谱 激发和发射单色器同时进行扫描，改变发射波长em与激发波长ex之间的波长差15nm, emex,令激发波长在250-320nm范围内扫描，得到木瓜酶和不同浓度的唑啉钠或呋辛钠的混合液中酪氨酸生色团的荧光光谱图。改变发射波长em与激发波长ex之间的波长差=60nm，得到木瓜酶和不同浓度的唑啉钠或呋辛钠的混合液中色氨酸生色团的荧光光谱图。2 结果与讨论2.1 荧光光谱研究木瓜蛋白酶分子中因含有色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸等氨基酸残基而产生较强的内源荧光，如图1和图2示，随着唑啉钠或呋辛钠的浓度的加大，木瓜酶在345nm处的荧光发射峰出现明显的猝灭现象，说明唑啉钠或呋辛钠与木瓜酶发生了强烈的作用。图1 唑啉钠与木瓜酶相互作用的荧光图 图2 呋辛钠与木瓜酶相互作用的荧光图C（木瓜酶）=110-6,from 2 to 7, C(唑啉钠)= C（木瓜酶）=110-6,from 2 to 6, C(呋辛钠) = 2,4,6,8,10,12（10-6mol/L）(T=298K,pH=7.4,) 2,4,6,8,10，（10-6mol/L）(T=298K,pH=7.4)荧光猝灭过程分为静态猝灭和动态猝灭，对于静态猝灭，温度升高，降低复合物稳定性，猝灭常数减小。动态猝灭，猝灭常数随温度升高而增大。动态猝灭过程中，蛋白质荧光体与荧光猝灭分子间的相互作用可以用Stern-Volmer动态方程描述： F0/F =1+KSVQ=1+kq0Q (1) 其中F0和F分别为不存在和存在荧光剂时的荧光强度，kq为双分子猝灭过程的猝灭速率常数，0 =10-19s6.7，为猝灭剂不存在时生物大分子的荧光寿命，Q为猝灭剂浓度，KSV 为Stern-Volmer 猝灭常数. 根据方程(1), 以F0/F 对Q作图可求得KSV, 进而通过下面的方程即可求出双分子猝灭过程的速率常数kq. kq= KSV/0 (2)为了确定唑啉钠对木瓜蛋白酶的荧光猝灭机理,分别测定了288, 298 和303K,pH为7.4时唑啉钠对木瓜蛋白酶的荧光猝灭光谱. 根据Stern-Volmer方程, 以F0/F 对Q作图得图3, 所得猝灭常数及相关系数列于表1.为了确定呋辛钠对木瓜蛋白酶的荧光猝灭机理,分别测定了288, 298 和310K,pH为7.4时呋辛钠对木瓜蛋白酶的荧光猝灭光谱. 根据Stern-Volmer方程, 以F0/F 对Q作图得图4, 所得猝灭常数及相关系数列于表2. 图3 唑啉钠与木瓜酶在不同温度下 图4 唑啉钠与木瓜酶在不同温度下的Stem-Volmert图 Stem-Volmer图 表1 不同温度下唑啉钠与木瓜蛋白酶相互作用的Stern-Volmer 猝灭常数及相关系数pH T/K Ksv/ kq/ Ra (104L.mol-1) (1012L.mol-1.s-1) 288 1.89 1.89 0.998747.4 298 1.62 1.62 0.99914303 1.23 1.23 0.99728 表2 不同温度下呋辛钠与木瓜蛋白酶相互作用的Stern-Volmer 猝灭常数及相关系数pH T/K Ksv/ kq/ Ra (104L.mol-1) (1012L.mol-1.s-1) 288 1.73 1.73 0.987197.4 298 3.07 3.07 0.98970310 3.12 3.12 0.99605从表1中可知，不同温度下kq的值远大于2.01010L.mol-1.s-1,同时随着温度的升高，猝灭常数Ksv的值逐渐减小，这说明唑啉纳对木瓜蛋白酶的猝灭应该是生成复合物的静态猝灭。有表2知，随着温度的升高，Ksv在增大，似乎预示是动态猝灭，但随温度升高，Ksv变化并不十分明显，一般生物大分子的最大扩散控制的碰撞猝灭常数kq数量级为2.010108，而表2中kq的数量级是1012，从这点考虑，猝灭应该是静态猝灭4。在静态猝灭中, 结合常数K 与荧光强度、猝灭剂浓度之间的关系可以用Lineweaver-Burk 双倒数函数表示： (F0/F)-1=F0-1 + K-1F0-1Q-1 (3) 式(3)中K 为结合常数, 以1/(F0F)对1/Q作双倒数图得图5，图6，由图5求得唑啉钠与木瓜蛋白酶的结合常数K，结果见表3，由图6求的呋辛纳与木瓜蛋白酶的结合常数K，结果见表4。图5：不同温度下木瓜蛋白酶-唑啉钠体系的Lineweaver-Burk 曲线 图6：不同温度下木瓜蛋白酶-呋辛钠体系的Lineweaver-Burk 曲 线 表3 不同温度下木瓜蛋白酶-唑啉钠体系的结合常数及热力学函数pH T/K K(104L.mol-1)Ra G0 (kJ.mol-1) H0(KJ.mol-1) S0(J.mol-1.k-1) 7.42882983031.991.791.580.995780.999290.99652-23.72 -24.18-24.41 -10.645.56表4 不同温度下木瓜蛋白酶-唑呋辛钠体系的结合常数及热力学函数pH T/K K(104L.mol-1)Ra G0 (kJ.mol-1) H0(KJ.mol-1) S0(J.mol-1.k-1) 7.42882983101.900.830.600.987160.989700.99605-23.35 -22.83-22.21 -38.32-51.97由表3和表4可以看出, 唑啉钠和呋辛钠与木瓜蛋白酶的结合常数K 较大, 说明唑啉钠和呋辛钠能够被木瓜蛋白酶储存和转运.此外, 结合常数K 随温度的升高而降低,复合物的稳定性降低, 两者之间的作用逐渐减弱. 由此进一步证明唑啉钠和呋辛钠对木瓜蛋白酶的猝灭属于静态猝灭类型.唑啉钠和呋辛钠与木瓜蛋白酶的相互作用引起木瓜蛋白酶分子构象的改变, 从而使木瓜蛋白酶分子发生荧光猝灭.2.2 作用力类型的确定猝灭体和生物生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、氢键作用力、范德华力和静电引力等，温度相差不大时，可以把反应焓变视为常数，根据lnK=-H0/RT + S0/R可计算出唑啉钠和呋辛钠与木瓜酶作用过程的焓变，吉布斯自由能和熵变，结果见表3，表4由表3可以看出: G00，H00, S00，表明唑啉钠与木瓜酶作用是一个熵增加，吉布斯自由能减小的自发过程，根据热力学函数与作用力之间的关系9.10.11.12.13，可以推断唑啉钠与木瓜酶主要以疏水作用力和氢键为主。由表4知G00，H00, S00，表明呋辛钠钠与木瓜酶作用是一个熵减小，吉布斯自由能减小的自发过程，根据热力学函数与作用力之间的关系，可以推断呋辛钠与木瓜酶主要以范德华力和氢键为主。2.3 木瓜酶与唑啉钠或呋辛钠之间的结合距离 根据Forster偶极-偶极非辐射能量转移理论14，供能体（木瓜酶）的荧光发射光谱与受体（呋辛钠或唑啉钠）的紫外吸收光谱有足够的重叠；供能体和受能体之间的距离不超过7nm时，将会发生非辐射能量转移现象，从而使荧光体荧光猝灭。在非辐射能量转移E，供能体和受能体之间的距离r及临界转移距离R0有如下关系式： E=R06(R06+r6) (6) 式中R0是转移能量为50时的临界距离：R06 =8.810-25（K2n-4J） (7) 式中K为偶极空间取向因子，可取供能体和受能体各项随机分布的平均值K2=2/315，n为介质的折射指数，可取水和有机物的平均值，n=1.336, 为供能体荧光量子产率，对木瓜酶去色氨酸的量子产率为0.11815， J =F()() 4/ F() (8) 式中，F()为供能体在波长时的荧光强度， ()为受体在时的摩尔吸收系数，能量转移效率由下式求出： E=1-F0/F (9)式中F为木瓜酶浓度和唑啉钠或呋辛钠浓度为1:1时木瓜酶的荧光强度，将图中的光谱重叠部分分割成极小的矩形，由式（7）求出R0，再由式（9）得到能量转移效率，代入式（6）求的r，通过计算，得出唑啉钠与木瓜酶反应中r=1.53nm, 呋辛钠与木瓜酶反应中r=2.52nm,都不超过7nm,说明唑啉钠和呋辛钠与木瓜酶反应发生了非辐射能量转移。图7 a为木瓜酶浓度和唑啉钠浓度都为110-6 图8 a为木瓜酶浓度和呋辛钠浓度都为110-6 mol/L时木瓜酶的荧光强度，b为唑啉钠浓度为 mol/L时木瓜酶的荧光强度 b为呋辛钠浓度110-6mol/L，Tris为空白时的紫外吸收光谱 为110-6mol/L，Tris为空白时的紫外光谱2.4 紫外吸收光谱研究对于研究药物分子与蛋白质的相互作用, 紫外吸收光谱法是一种简单有效的方法. 蛋白质之所以能产生紫外吸收光谱, 其主要原因是Trp, Try 和Phe 等氨基酸残基对光的吸收引起的, 此外还有肽键对光的强烈吸收.在280 nm 左右的吸收峰是由Trp, Try 和Phe 三种芳香族氨基酸引起的. 为了证明加入唑啉钠或呋辛钠后木瓜蛋白酶的结构变化, 实验测定了呋辛钠或唑啉钠存在下木瓜蛋白酶的紫外吸收光谱，发现加入唑啉钠或呋辛钠后，木瓜蛋白酶在约280 nm 左右的吸收峰的峰强增强，并且峰位发生红移，（图9和图10）表明加入唑啉钠或呋辛钠后，引起了芳香族氨基酸残基的微环境发生了变化，芳香族氨基酸残基的疏水性增强，从而导致了木瓜蛋白酶分子的构象发生了改变. 而蛋白质分子构象的改变正是引起荧光发生猝灭的原因，因此这与荧光光谱研究的结果很好的符合。图9 唑啉钠对木瓜酶紫外吸收光谱的影响 图10 呋辛钠对木瓜酶紫外吸收光谱的影响2.4 同步荧光法研究TH1314 与生色团的结合及对木瓜蛋白酶构象的影响对于蛋白质的同步荧光光谱，15 nm时仅表现出酪氨酸残基的荧光，60 nm 时仅表现出色氨酸残基的荧光。由于氨基酸残基的最大荧光波长与其所处环境的疏水性有关16，所以由荧光波长的改变可以判断蛋白质构像的变化。固定木瓜酶的浓度而逐渐增大唑啉钠或呋辛钠的浓度，记录15 nm和60 nm时的同步荧光光谱。（图11和图12） 图11 唑啉钠与木瓜酶蛋白在 15 nm 的同步荧光光谱 图12 呋辛钠与木瓜蛋白酶在 15 nm 的同步荧光光谱实验发现随着唑啉纳浓度的增大，酪氨酸残基荧光被猝灭，色氨酸残基荧光没有明显猝灭，说明唑啉纳与木瓜酶作用更接近与酪氨酸残基。酪氨酸残基最大发射波长位置没有发生改变，唑啉纳与木瓜酶发生了作用，但没有进入木瓜酶的疏水腔中，木瓜酶的构想没发生变化，疏水性微环境未发生变化。随着呋辛钠浓度的增大，酪氨酸残基和色氨酸残基荧光被猝灭，同时酪氨酸残最大发射波长位置发生明显红移，说明呋辛纳与木瓜酶酪氨酸残基发生作用，酪氨酸残基的微环境极性增强，木瓜酶的构象发生了变化，与色氨酸残基发生作用，但构象没发生明显的变化。3 总结和展望本文利用荧光光谱、紫外吸收光谱研究了唑啉钠和呋辛钠与木瓜蛋白酶的相互作用. 紫外吸收光谱和同步荧光光谱揭示了呋辛钠和唑啉钠对木瓜蛋白酶构象的影响；荧光光谱表明呋辛钠和唑啉钠对木瓜蛋白酶的猝灭机理属于静态猝灭类型.根据有关方程分别求得不同温度下药物与蛋白质相互作用的结合常数，并通过热力学方程计算出不同温度下的热力学参数, 进而确定了二者之间的主要作用力.我们应用荧光光度法具有操作简单，灵敏度高，费用较低等特点，该研究对于阐明头孢类化合物在血液中的存在状态，游离浓度及在体内代谢过程，对于研究药代动力学以及以蛋白为靶的药物分子的筛选和设计有重要意义。参考文献1 Cao, S.-X.; Zhao, Y.-F. 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