（微生物学专业论文）rhodococcus+erythropolis+ds3脱硫条件优化与脱硫机理及多相分类研究.pdf

南开大学硕士毕业 学位 论文摘要 摘要 生物脱硫 b d s 是最近飞速发展的一种新型 环保型生物技术 b d s 可在常温常压 下利用需氧菌或厌氧菌选择性地脱除燃料油中的有机硫 专一切开c s 键而不破坏c c 键 从而保留了油品的热值 本文以d s 一3 为材料 二苯并噻吩 d b t 为脱硫模型化合物 进行了较系统的生物 脱硫研究 主要工作如下 d s 3 菌株经过长时间的反复驯化 对d b t 的脱硫能力提高了2 5 倍 通过均匀设计 法对d s 3 菌株脱硫培养基进行了优化 与原基础培养基相比其脱硫效率提高了1 0 研 究发现 f m n n a d h 和v b 能促进d s 3 生长和脱硫 高浓度的硫酸根离子会影响脱硫 酶的表达 对d s 3 的脱硫机理做了初步探讨 红球菌d s 3 菌体表面具有强烈的疏水性 正 是这种疏水性使红球菌具有亲油的特性 红球菌d s 3 在对数生长期能产生海藻糖脂型 表面活性剂 有助于菌体摄取有机物作为自身生长的碳源和硫源 d s 一3 偏好利用有机 硫源 红球菌的脱硫酶以可溶形式存在于胞内 初步认为是组成型酶 比较了生长细胞 固定化细胞和休止细胞的脱硫效果 确定休止细胞循环脱硫法效果 最好 0 4 柴油和精制柴油的最终脱硫率分别为6 4 0 8 年n8 5 8 6 g c m s 分析表明 d s 一3 能脱除d b t 及d b t 衍生物 首次进行了乙醇配合低速离心对柴油脱硫后乳状液进行破乳的研究 该工艺操作简 便 成本低廉 无毒害 不影响油品热值 菌体可回收再利用 采用多相分类技术对d s 3 菌株的形态特征 生理生化指标和细胞壁组成等表形特征 及g c m 0 1 1 6 s r d n a 和d n a d n a 分子杂交等遗传学特征进行了研究 确定d s 3 的 分类地位为r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 命名为r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i sd s 一3 探讨了采用b i o s t a t c 1 0 3 自控罐进行d s 一3 发酵脱硫 并建立了相应的动力学模型 关键词 生物脱硫 红球菌 二苯并噻吩 固定化细胞 休止细胞 破乳 多相分类鉴定 南开大学硕士毕业 学位 论文摘要 a b s t r a c t b i o d e s u l f u r i z a t i o n b d s i san e w l yh i g hd e v e l o p i n ga n de n v i r o n m e n t a l l yb e n i g nb i o t e c h n o l o g y b d s i nw h i c ha n a e r o b i cb a c t e r i ao ra e r o b i cb a c t e r i aa r eu s e di nt h es e l e c t i v er e m o v a lo fs u l f u r f r o mp e t r o l e u ma n di t sd i s t i l l a t e s i sc s b a n d t a r g e t e db u t c c b a n d t a r g e t e df a s h i o ns ot h a ti t c a n k e e p t h ec a l o r i cv a l u eo ff u e l t h ea u t h o rs t u d i e do nt h es y s t e m i cr e s e a r c ha b o u tb d sw i t hr h o d o c o c c u s s pd s 3a n dd b t a s t h em o d e l c o m p o n e n t t h ep r i m a r ys t u d i e sa sf o l l o w s a f t e rl o n gt i m en a t u r a l i z a t i o n t h ed e s u l f u r i z a t i o na c t i v i t yo fd s 一3h a si m p r o v e d2 5t i m e s t h e a u t h o rg o tab e t t e rm e d i u mf i tf o rd s 3t od e s u l f u r i z ed b t u s i n gu n i f o r md e s i g ne x p e r i m e n t a n di m p r o v e dt h e g r o w t ha n dd e s u l f u r i z a t i o ne f f i c i e n c yb y8 a n d10 r e s p e c t i v e l y t h e t r a n s f o r mr a t i oo fd b tt o2 一h b pi sa b o u t8 8 7 t h em e c h a n i s m so ft h ed s 3d e s u l f u r i z a t i o na r ea sf o l l o w s t h es u r f a c eo fd s 3c e l l si s s t r o n g l yh y d r o p h o b i cw h i c hm a k e sd s 3m o r ee a s i l yc o n t a c to r g a n i cc o m p o u n d s d s 3c a n p r o d u c eb i o s u r f a c t a n tw h i c h i sf u c o s eg l u c o l i p o i da n d h e l pd s 一3t a k i n ga l k a n ea n dd b t a ss o l e c a r b o f ia n ds u l f u rs o u r c e sr e s p e c t i v e l d s 一3l i k e st ou s eo r g a n i cs u l f u rs o u r c e s d s zw h i c h a r ei n t r a c e l l a rs o l u b l ea r ec o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o n c o m p a r i n gw i t ht h eg r o w t hc e l l s t h ei m m o b i l i z ec e l l sa n dt h er e s t i n gc e l l s t h ee x p e r i m e n t r e s u l t ss h o wt h a tt h er e s t i n gc e l l sh a v eh i g h e rd e s u l f u r i z a t i o ne f f i c i e n c y t h ea u t h o rs t u d i e d c i r c l e d e s u l f u r i z a t i o no fd i e s e lo i l su s i n gr e s t i n gc e l l s a n dt h ef i n a le f f i c i e n c yo ft h ep u r i f i c a t o r y a n d0 4d i e s e lo i li s8 5 8 6 a n d6 4 0 8r e s p e c t i v e l y g c m sa n a l y s i ss h o w sd s 3c a nd e s u l f u r i z e d b ta n dd b t d e r i v a t i v e s b u tc a l ln o td e s u l f u r i z eb e n z o t h i o p h e n e b t a n db t d e r i v a t i v e s t h e r e a p p e a r st h r e e p h a s e d i e s e l b a c t e r i ac e l l a q u e o u sp h a s e e m u l s i o n a f t e rd i e s e lo i l b i o d e s u l f u r i z a t i o n 4 e t h a n 0 1 a sad e e m u l s i f i e r w i t ht h el o wc e n t r i f u g ef o r c ec a ns e p a r a t eo i l i ti sa l s oi n n o x i o u s c h e a p e le a s i l ym a n i p u l a t i n ga n dd o e s n ta f f e c tt h ec o n s i s t e n to fa l k e n e s t h e p e l l e t so f d s 一3c e n t r i f u g e dh a v et h es a m eg r o w t hr a t e sa n dd i b e n t h i o p h e n ed e s u l f u r i z a t i o n r a t e sa st h eo r i g i n a lb a c t e r i a s ot h e yc a nb er e u s e da sd e s u l f u r i z a t i o nb i o c a t a l y s t t h ea u t h o ri d e n f i f yt h et a x o n o m ys t a t u so f t h es t r a i nd s 3b y p o l y p h a s i ct a x o n o m yi n c l u d i n g t h e p h e n o t y p e g c m 0 1 1 6 s r r n a d n a d n a m o l e c u l a rc r o s sa n dp h y l o g e n e t i ci n f o r m a t i o n s a n dt h es t r a i nd s 一3w a si d e n t i f i e da sr h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sa n dn a m e dr h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i sd s 3 s t u d yo nt h ek i n e t i c sa n a l y s i so fg r o w t ha n dd e s u l f u r i z a t i o no f d s 一3d u r i n gf e r m e n t a t i o n a n d t h ea u t h e re s t a b l i s h e dt h ed y n a m i c a lm o d e lo fc o n t r o l l i n gt h eg r o w t ha n dd e s u t f u r i z a t i o no f d s 3 k e yw o r d s r h o d o c o c c u ss p p o l y p h a s i ct a x o n o m y b i o d e s u l f u r i z a t i o n d i b e n z o t h i o p h e n e d b t d e s u l f u r i z a t i o ne n z y m eg e n e d i e s e lo i l i m m o b i l i z e dc e l l s r e s t i n gc e l l s d e e m u l s i f y i i 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 1 微生物脱硫概况 第一部分前言 1 1 燃料油脱硫的必要性 随着全球环保意识的不断增强和环保管理法规的日趋严格 维护生态平衡出发的绿色 化学与化工正日益在全球范围内受到广泛重视 全球工业化进程的迅猛发展使得国内外燃 料油的用量越来越大 矿物燃料的需求量剧增 仅中东地区每天约有8 0 0 0 万桶 约1 0 0 0 万吨 的原油被开采出来 我们日常所用的燃料油主要来自原油 不同来源的燃料油中硫 含量相差很大 其重量百分比大约在o 0 3 1 0 的范围内变化 3 含硫的液体和固体燃料 在燃烧时将产生大量的硫氧化物 这些物质具有多方面的危害性 1 腐蚀作用 二硫化物稳定性较差 加热易分解成h 2 s 与水共存时呈酸性 会严 重腐蚀设备 如果油品中含有m g c l 2 c a c l 2 等盐类 会水解生成盐酸 腐蚀更为严重 1 温度达到3 5 0 4 0 0 c 左右时 活泼的元素硫极易与普通钢材生成硫化亚铁 硫醇也能直 接与铁作用生成硫醇铁而腐蚀设备 1 2 酸雨效应 含硫燃料燃烧后生成的s 0 2 s 0 3 极易与大气中的水蒸气化合成h 2 s 0 3 和h 2 s 0 4 蒸汽 含硫的烟气对人体和动 植物都有很大的毒害 此外 燃烧排放的二氧化 硫在空气中一旦被氧化 就会与水蒸气形成酸雨 严重影响生态环境和人们的日常生活 现在世界各地相继出台法律法规 以限制燃料油中的含硫量 使用低硫燃料油是大势 所趋 世界各国制定的s 0 2 限制排放法规也越来越严格 1 9 8 7 年美国环境保护协会 e p a 开始严格控制空气质量 1 9 9 0 年美国通过了 大气清洁法修正案 c l e a n a i r a c t a m e n d s 规定汽油硫含量的标准不大于l o o m g l 柴油硫含量不大于3 5 0 m g l 并在不久的将来 2 0 0 5 2 0 0 7 年 达到 无硫 的要求 低于1 0 1 5 m 玑 1 9 9 6 年6 月 加州规定燃料 油中硫含量的标准是不大于3 0 m g l 1 目前我国石化总公司与国家环保局制定的燃料柴 汽 油的最高含硫量为8 0 0 m g l 而欧美规定的最高量为5 0 m g l 美国每年花费在燃料 运输和原油脱硫加工上的费用高达3 7 3 0 亿美元 巨大的开销迫使石油工业必须改革现行 的原油脱硫催化技术 1 并开辟微生物脱硫新途径 而我国由于经济和技术因素的原因 大大制约了燃料油脱硫的工业化进程 然而 随着我国加工进口高硫原油数量的增加和环 保意识的不断增强 柴油低硫化势在必行 1 随着工业的迅猛发展和中国加入w t o 的进 程 对石油及燃料油进行脱硫处理将成为炼油工业所面临的极重要的课题之一 1 2 燃料油脱硫的常用方法 长期以来 炼油工业一般采用碱洗的方法来脱除油品中的硫化物 这一方法较为简单 但存在诸多问题 如环境污染严重 脱硫效率低等 原油通过碱洗 可以除去油品中的绝 南开大学硕士毕业 学位 论文第一部分前言 大部分硫化物 但却产生大量的含硫废水 如果不加以妥善处理 对环境的危害会相当严 重0 1 此外 由于碱洗对有机硫化物的脱除率低 油品中还含有不同程度的有机硫化物 加氢脱硫法 h y d r o d e s u l f u r i z a t i o n 以下简称h d s 是从燃料油中脱硫的一种常用的 传统技术 在加氢脱硫过程中 石油馏分在无机催化剂和氢气的催化下在高温高压下将有 机硫分子转化成h 2 s h 2 s 经过处理生成元素硫 但是用h d s 法把硫降到很低的水平 不 仅成本高而且效率很低 特别是脱除有机硫 尤其是带苯环的硫化合物效果更差 以此看 来h d s 技术显然不能满足油品深度脱硫的需要 生物脱硫法 b i o d e s u l f u r i z a t i o n 以下简称b d s 又称生物催化剂脱硫 这是一种在 常温常压下利用需氧或厌氧菌除去结合在杂环化合物中的有机硫的一种环保型生物技术 脱硫细菌中的酶可以有选择的氧化硫原子进而切开碳硫键 而其烃骨架不受影响 不影响 烃的燃烧热值 b d s 技术与h d s 技术相比有许多优点 能在常温常压下操作 二氧化碳 排放量和能耗较低 投资和操作费用少 表1 1 1 表1 1 生物脱硫与加氢脱硫的能耗及c 0 2 生成量的比较 t a b l e 1 1c o m p a r i s o no fe n e r g yc o n s u l a n dd i o x i d ec a r b o np r o d u c t i o no f b i o d e s n l f u r i z a t i o na n d h y d r o d e s u l f u r i z a t i o n b d s 发展迅速 应用十分广泛 作为h d s 的补充 将b d s 和h d s 联合操作能更加 有效地提高脱硫效果 1 1 3 燃料油中的含硫组分及模型化合物d b t 原油中的硫大致可分为无机硫和有机硫 无机硫主要由溶解或悬浮在油中的元素巯 硫化氢和硫化物等组成 而原油中大部分硫是有机硫 由各种硫醇 硫醚和噻吩及其衍生 物组成 美国石油协会 a p i 将它们分为1 3 种 图卜1 1 蠢蝴 卢n 5 轴 雌鍪一 o 氓回 矗化镥 s s 一筅9 勺q n 盯 图1 1 石油中的禽硫化合物 f i g 1 一is u l 如rc o n t a i n i n gc o m p o u n di np e t r o e u m 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 燃料油中的无机硫化台物以及部分有机硫化合物尤其是噻吩类小分子含硫化合物可 以经过加氢脱硫法除去 1 0 但二苯并噻吩 d i b e n z o t h i o p h e n e d b t d b t s 及带有不同侧 链的d b t s 用加氢脱硫法很难除去 因此 燃料油生物脱硫的研究实质上就是对二誉并噻 吩及其衍生物中硫元素进行生物降解的研究 d b t 就成为了现代脱硫技术研究的模型化合 物 2 微生物脱硫的发展史及其基本原理 2 1 微生物脱硫的发展史 二十世纪5 0 年代就首次报道了微生物脱硫技术 1 9 5 0 年和1 9 5 3 年 s t r a w i n s k i 和z o b e l l 等人创立了微生物溶解性脱硫体系 其主要过程是针对原油中的有机硫化合物 利用微生 物将其转化为水溶性物质 进而用水把它从油相中洗脱出来 但是由于条件和技术所限 这种方法最终并没有实现商业化 1 9 7 3 年 k o r k ik o d a m a 等人在研究苯环化合物对农作物生长影响时发现产碱假单胞 菌属的 p s e u d o m o n a s a l c a l i g e n e s 可以将d b t 氧化成为几种不同的水溶性产物 氧化的结 果是d b t 苯环中的c c 键发生断裂 使苯环分子最终变成了水溶性较强的分子 但硫并 没有从分子中除去 图1 2 另外 k o d a m a 还发现 除了使d b t 上苯环的c c 键断裂 的途径外 这类细菌还有可能将d b t 氧化成水溶性的d b t 亚砜或d b t 砜 但没有检测 到进一步氧化使硫从d b t 分子中释放出来 后来这条氧化途径就被称之为k o d a m a 途径o 馥吖一嘶 器写矗芒i 萼雷擎o d 时 i q 妻嗍一堪 避 城他鲁 蔫嘲弹 的 孵吨一咩q i 图i 2 生物脱硫的k o d a m a 途径 f i g 1 2t h e k o d a m a p a t h w a y o f b i o d e s u l f m i z a f i o n 1 9 7 4 年 v e bp e t r o c h e m i s c h e sk o m b i n a ts c h w e d t 公司用从含油土壤中分离到的混合 菌 在装有油的4 升发酵罐中进行培养 五天内脱去原油中5 5 的硫 但也损失了3 0 的 原油 随后 u n o c a l 公司报道用假单胞菌将有机硫化物降解成为水溶性产物 并产生表面 活性剂 有利于油水接触 但其脱硫效率较低 仅为传统h d s 的1 1 0 蠹 蓍l 叩妙 南开大学硕l 毕业 学位 论文 第一部分前言 以上研究工作都是建立在以k o d a m a 途径分解d b t 的基础之上的 利用这些细菌虽然 能够降解有机硫化物 但并没有真正将硫原子从有机硫化物上脱除下来 仅仅是将之与油 相分开 也不可避免地对油中的芳香烃类造成破坏 脱硫后燃油中有价值成分大为减少 使燃料的利用率大大下降 1 9 8 8 年k i l h a n e 首次分离出具有生物脱硫的4 s 途径的细菌 与k o d a m a 途径不同 的是 这株菌可以经过4 步反应将硫原于从d b t 上脱下来 生成硫酸根和二羟联苯 2 h b p 这条途径被称之为4 s 途径 图1 3 后来 又有许多学者分离到了新的可由4 s 途径降解d b t 的菌株 1 9 9 2 年 美国天 然气研究所 i g t 分离到一株玫瑰色红球菌 r h o d 0 0 0 c 0 r h o d o c h r o u s i g t s 8 1 9 9 4 年i z u m i 等人从土壤中分离到红平红球菌 re r y t h r o p o l i s d 一1 可在4 8 小时内通过4 一s 途径完全降解浓度为0 1 2 5 m m o l l 的d b t 1 9 9 5 年 o m o r i 等人还筛选到了既可利用 d b t 又可利用二甲基硫化物 d m s 二甲基亚砜 d m s o 中硫的红球菌r h o d o c o c c u s s y l 1 9 9 8 年 r h e e 等人分离到可用于柴油脱硫的戈登氏菌g o r d o n ac y k s l 可以在 十 d 时内将中馏分油的含硫量从o 1 5 降至o 0 6 自此 生物脱硫技术的发展进入 了新的阶段 有关国家和各石油厂家和公司投入巨额资金积极开发生物脱硫技术 o o 馨蕾攀峨 图1 3 牛物脱硫的4 s 涂榫 f i g 1 3t h e4 sp a h w a yo f b i o d e s u l f u r i z a t i o n 2 2 微生物脱硫的基本原理 2 2 1 脱硫基因和脱硫酶 d o e 匹兹堡能源研究中心的r h e e 和l a i nc a m b e l l 教授首先提出了d b t 经细菌脱硫而 保留烃的四步反应模式 4 s 生物脱硫过程总的反应步骤可由图1 4 b 来表示 1 首先 将d b t 分子从油转运到细胞中 2 在d b t 单加氧酶 d s z c 催化下 d b t 先后氧化成 d b t 亚砜和d b t 砜 一个电子从f m n h 2 转移到d b t 上 生成氧化的f m n d b t o 和 4 叩 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 d b t 0 2 d b t 单加氧酶先把d b t 催化氧化成亚砜 继而氧化成砜 3 d b t 砜单加氧酶 d b t 0 2 一m o 催化分裂篇一个c s 键 f m n h 2 d b t 氧化还原酶将另一个电子从f m n h 2 转移到d b t 0 2 在细胞中 这种酶 d s z a 起着类似二聚物的作用 4 最后一步反应 将会生成皿硫酸盐和一个完整的烃分子 该反应用脱硫酶 d s z b 作催化剂 硫以亚硫酸 盐的形式释放 同时生成油溶性的羟基联苯 同时经研究发现 这三种酶的基因呈簇排列于一线状质粒p s o x 1 0 0 一1 5 0 k b 上 图 1 4 a 是受同一操纵元调控的基因 脱硫基因簇由三个开放阅读框架 o r f d s z a b c 组成 d s z c 基因编码d s z c 4 5 3 个氨基酸 m 4 9 5 7 9 d a d s z a 编码d b t 砜氧化酶 d s z a 3 6 5 个氨基酸 m 3 9 0 0 1 d a d s z b 编码脱硫酶 d s z b 4 1 7 个氨基酸 m 4 4 9 7 7 d a d s z c 与一些乙酰c o a 脱氢酶有同源序列 但是 这种相似性的分子基础还不明白 d s z a 同 s t r e p t o m y c e sp r j s t i n a e s p i r a l i s 抗革兰氏阳性菌素i i a 合成酶的s n a a 亚基和c h e l a t o b a c t e r a t c c2 9 6 0 0 的亚硝酸盐单加氧酶组分b n m o b 有很高的相似性 而d s z b 的氨基酸序 列与数据库中的蛋白没有大的同源性 1 除了已经发现的r h o d o c o c c u se r y t h i o p o l i s i g t s 8 外 目前在很多菌中均发现了能脱硫 的d s z 基因或类似于d s z 的脱硫基因 这些菌包括p a e n i b a c i l l u ss p g o d o n as p n o c a r d i as p b a c i l l u ss p p s e u d o m o n a ss p 和c o r y n e b a c t e r i u ms p 并且这些菌的脱硫基因均有很高的序 列同源性n 曲 2 业 龃 黔h a 葡 富一 b l b l 2 0 爿蹄f i v i i m z nc 溢 2 l n 日 d b t s m m ec 葸卫9 d l df n j i 阿 裂蹄 踟出c 譬 2 一a h y d po 户一 p h e n y 1 一 固 n 9 鸥o 司伽 z n r a r x y b p h e n y l 二 s o 2 一 图卜4 催化各步反应的酶及其催化步骤 f i g 1 4t h ee n z y m e sc a t a l y z i n gt h ee a c hs t e po f t h er e a c t i o n 2 2 2 脱硫过程的分子转运转化假设模型 图1 5 列出了假设的d b t 分子转运和一系列酶促反应过程 由图中可以看出 一旦 5 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 c x d b t 进入细胞将进行一系列氧化过程 其中最先被两步d b t 单氧化酶催化的步骤成为 一个重要的限速步骤 它需要由n a d h f m n 氧化还原酶提供的还原性的黄素单核苷酸 f m n 为辅酶 并在氧的存在下进行 很多经4 s 途径参与反应的微生物的第一步都是 限速步骤 因为对产物的色谱分析显示没有任何中间产物存在 证明第二 三步反应都以 极快的速度进行 可以说是瞬时的 基因的排列顺序也可以证实这 结果 三个编码脱 硫酶的基因是以d s z a 如b d s z c 的顺序排列 它们同处于一个操纵子下共用一个启动子 那势必会造成离启动子越远的基因转录的m r n a 和翻译的酶就会越少的结果 而参与反应 的顺序则是d s z c d s z a d s z b 由此可以说明当少量d s z c 参与反应时 细胞内已经积 累了大量的d s z a 和d s z b 因此一旦生成d b t 0 2 就会立即启动下面的反应 c x d b t 脱硫代谢的最后一步是脱硫酶释放无机硫 这也是一步特殊的反应 生成一 种难溶的芳香分子h b p 和硫 h b p 可溶于油 并能重新回到油中被利用 不损失油的燃 烧值o 但是目前还不清楚是否有某种主动运输方式运出细胞 图卜5 脱硫过程的假没示意图 f i g 1 5h y p o t h e t i c a lp r o c e s so f d b t xb i o d e s u l f u r i z a t i o n 对脱硫机理更进一步的了解是通过脱硫基因在假单胞菌中的表达实现的 k o c h 曾报 道过鼠李糖脂在铜绿假单胞菌利用正十六烷过程中的重要性 加入正烷烃能大大提高菌体 对d b t 的降解作用 证实铜绿假单胞菌对烷烃的摄取有利于同时利用烷烃中的d b t 此外 不同重组假单胞菌对不同碳链长度的 f 烷烃的摄取能力各不相同 d b t 从油到水 的转运速度可以限制d b t 的降解速度 增加膜的流动性也有利于对烷烃的摄取 继而能 提高脱硫效率 尽管其他d b t 降解菌和酶的相关报道也很多 但仍有许多重要问题尚待解决 最重 6 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 要的问题是d b t 及烷基化的d b t 这些难溶分予如何进入细胞并被d b t 单氧化酶氧化 另一个重要的问题是脱硫后菌体是否利用硫酸根分子作为硫源 多余的硫酸根是否排出胞 外 并如何把产物2 h b p 排出胞外 阐明这些问题将会对理解c x d b t 脱硫速率 限制 程度和含硫烃降解机理将有重要作用 3 微生物脱硫国内外研究进展 3 1 脱硫工艺的研究进展 3 1 1 休止细胞脱硫 生长细胞受到外界化学如一些化学物质包括乙醇 苯酚类物质 过氧化物 重金属等 作用或物理作用后其细胞内基因表达 蛋白稳定性会相应地发生变化 生长旺盛的细胞 很容易受到这些化学或物理的作用 而处于低生长速率的休止细胞则对这些外界作用反应 不如生长细胞敏感 因此 当外界环境影响生长细胞体内一些生化反应时 采用休止细胞 可以避免这些影响 在生物脱硫的研究中休止细胞脱硫应用非常广泛 对于野生菌和基因 工程菌株的休止细胞脱硫的研究国内外都有许多报道 用休止细胞脱硫较生长细胞脱硫 有许多优点 休止细胞体内酶量大因此可以大大提高脱硫效率 由于休止细胞菌体浓度大 接触底物d b t 的机率增加 据报道休止细胞在磷酸钾缓冲液 p h 7 o 中的脱硫能力比经过 1 2 0 h 培养的生长细胞的脱硫能力高5 0 在含有9 5 的十六烷中休止细胞仍然有很高的 脱硫能力 比在磷酸钾缓冲液 p h7 o 中的脱硫能力大5 这就使工业上应用休止细胞 脱硫成为可能 此外 休止细胞脱硫可以缩短脱硫时间 生长细胞迟缓期长 脱硫缓慢 在菌体培养中 d b t 脱硫而产生2 h b p 等物质对菌体生长有一定的抑制作用 休止细胞则 可以直接作用底物d b t 而缩短脱硫时间 这对工业微生物脱硫大有好处 我国的生物脱硫起步较晚 最早研究脱硫的是中国科学院北京微生物研究所钟慧芳等 人 她们在进行煤炭脱硫的研究工作中筛选到了3 株假单胞菌 可以利用d b t 作为碳源 最终可脱除煤炭有机硫的3 4 生态环境研究中心的闰海等人研究了乙醇和不同硫源对 红平红球菌脱硫酶活力的影响 3 山东大学许平等和南开大学的马挺等对燃料油微生物 脱硫及微生物脱硫的催化剂制备和条件作了研究 中科院过程所姜成英 刘会州等人对 微生物脱硫过程中的产物进q g t 分析 3 虽然我国的生物脱硫起步较晚 但在有效的专一 性脱硫菌种筛选和室内脱硫研究方面也取得了可喜的进展 3 1 2 固定化细胞脱硫 脱硫菌经过条件优化或基因工程改造后 尽管生物催化剂活性有所提高 但面临两个 严峻的问题 一是保证脱硫后油水的分离 二是生物催化剂活性的保持 研究发现 利用 固定化细胞技术可以较好地解决这些问题 细胞的固定化是在固定化酶基础上发展起来的 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 一种高新技术和方法 固定化细胞的出现较晚 但其应用的范围比后者更为广泛 它由研 究阶段进入生产应用的周期很大程度上超过了固定化酶 与游离细胞相比 固定化细胞有很多优点 能保持高的代谢活性 能被重复利用 能 对有毒物质产生保护作用 并且能克服底物抑制作用 其动力学分析发现游离细胞有较长 的滞后期 而固定化细胞的滞后期较短 目前 固定化细胞技术已成功应用到降解环境污 染物 如丙烯酰胺和酚类物质等 3 4 1 用到的载体有亲水的琼脂 海藻酸钠 海藻 酸钙 亲油的甲基硅橡胶 纤维乙酸 纤维聚砜薄膜 硅藻土等等 c h a n g 等人首次将固定化细胞技术应用于生物脱硫的研究 他们采用吸附法制备的固 定化细胞来研究脱硫后油水系统的分离 但是没有达到很好的效果 m a n a b u n a i t o 等人 研究了固定化红球菌k a 2 5 1 细胞的长期脱硫 利用d b t 和n 一十六烷作为模型油 比较 了海藻酸钙 琼脂 磷酯酰交联树酯 e n t 4 0 0 0 和e n t p 一4 0 0 0 p u 一3 p u 一6 等载体制备 固定化细胞的脱硫效果 最后以e n t 4 0 0 0 为载体的固定化细胞有较高的脱硫率 这项技 术解决了b d s 中回收脱硫后的油以及b d s 过程中生物催化剂的寿命短等问题 为固定化 细胞应用于生物脱硫的工艺开辟了道路 2 0 0 3 年 中国科学院北京过程所单国宾和邢建民等人研究了磁性聚乙烯醇固定化 p s e u d o m o n a sd e l a f i e l d i i 及其在生物脱硫中的应用i s 2 o 他们利用共沉降方法以形成磁性液体 含f e c l 3f e c l 2 再加入聚乙烯醇形成具有磁性的固定化细胞 这种固定化细胞比没有磁 性的聚乙烯醇固定化细胞优越 其脱硫能力提高了1 0 这种固定化细胞疏水 其优势在 于它有较高的脱硫活力 并且能保持形状 可重复利用7 次 而非磁性固定化细胞只能重 复利用3 次 这种固定化细胞易于从生物脱硫反应器中分离出来 3 1 3 生物反应器 b d s 技术已经带来了重要的经济效益 图1 6 给出了传统的脱硫流程 图1 6 b d s 的改进流程 f i g 1 6i m p r o v e di n d u s t r i a lt e c h n i q u ef l o wo f b d s 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 流程的关键问题是设计更先进的生物反应器以配置更有利的油一菌一水混合物 以及菌 体 副产物回收和油水分离系统 由图中看出 菌体先在发酵罐中发酵 制各种子液 然 后转入脱硫罐 此时加入柴油 在经过三次重复脱硫后 油水混合物进入两相油水分离系 统 分别分离出经过脱硫的油品和溶解存水相中的脱硫副产物 最后菌体可回收再利用 3 1 4 脱硫后的油水分离 破乳 技术 乳状液是指一种或多种液体以液珠形式分散在与它不相溶的液体中构成的粗分散体 系 由于体系显现乳白色而被称为乳状液 乳化剂是乳状液赖以稳定的关键 它可以吸附 在油水界面上形成单分子膜 有降低油水界面张力及阻止油珠并聚的作用而使乳状液稳 定 乳化剂主要分有四类 表面活性剂类 高分子型 天然产物类以及圆体粉末 影响 乳状液稳定的因素有界面引力 界面膜的性质 界面电荷和分散介质的粘度等l 使乳状液发生油水分离的现象称为破乳 破乳是一个复杂的过程 目前尚没有一个固 定的规律可循 近年来国内外对破乳的研究较多 均是根据乳状液特定的形成特点及离子 强度进行破乳剂的复配 或是利用了细菌或其代谢产物 如有机酸及表面活性剂等9 1 国外对破乳的研究颇多 成功地开发出了多种破乳方法 包括加热 强电 超声波 微波 化学破乳等方法 通过电化学方法 发现生物破乳剂的加入使得化学破乳溶液的界面膜 电容随时间增加的趋势明显 界面膜被击穿的时间缩短 而界面膜电阻随时间的下降程度 也相应增强 这充分说明生物破乳剂与化学破乳剂具有 协同效应 n a l i n a 等人从被 石油污染地点筛选出一混合菌群 发现它们具有很好的破乳活性 在一小时内可以使煤油 一水模型乳状液达到破乳率9 6 冻融和高压灭菌不影响其破乳活性 后证实是菌体粒子 和菌体产生的表面活性剂起到破乳作用 柴油的b d s 反应是在多相 油 水 菌体 体系中进行的 菌体自身的疏水性使其能更 好地接触到有机相进行脱硫反应 菌体产生的表面活性剂能将油相乳化成小液滴 多相体 系在乳化剂和强烈通风搅拌作用下反应会产生一种稳定的乳状液 这为b d s 后期的油水分 离带来了困难 并严重地影响了b d s 的工业化进程嘞1 目前 b d s 使用的破乳方法是离 心法和水力旋流器 h y d r o e y c l o n e 法 它将一种大约长1 m 直径5 1 0 c m 的锥形管替 代反应罐 液体从大的一头流入并开始旋转 密度大的部分 水 甩到管的外侧壁 轻的 在中间 分离的部分流到一个连续的装置中 这种方法的应用有很大潜力 因为它没有驱 动装置 能低成本地分离油一水混合物 同时能分离位于油一水界面处的菌体 此反应可循 环利用 通过控制混合相的组成 可以不消耗太多能量获得相对纯净的水或油 降低了生 成成本 但此方法的缺点是不能完全破乳 柴油回收率仍然十分有限 d b t 基团向细胞内的转运过程对于整个脱硫过程来说是至关重要的 但是这种转运作 用会加紧油水间的 亲密接触 从而导致紧密的乳状结构 因此要回收脱硫油 分离副 产物 就必须打散这种乳化结构 要使b d s 技术向产业化过渡 就必需开发出各种操作简 单 费用低廉 使油 水 菌体三相得以充分分离 无毒害 无污染 同时又能再生菌体的 破乳方法 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 3 2 生物脱硫的副产物及其应用 如今石油化工是一个很热门的学科 生物脱硫的副产物在这个领域也充当着重要的角 色 h b p 是一种有效的工业生物酸 并且是食品 化工 保健等行业的重要原料 脱硫的 另一个副产物磺酸盐是表活剂行业廉价的原料 苯乙烯和聚酯还是稀有材料下游工程廉价 的原料 此外 植物在酸性的土壤中往往会发育缓慢 产量降低 烟气生物脱硫的副产物 f g d b p s 能够改良贫瘠的酸性土壤 并给植物提供一定的营养元素尤其是钙离子 4 红球菌属的研究进展 4 1 红球菌属 r h o d o c o c c u sm 简介 1 8 9 1 年 z o p f 首先用 r h o d o c o c c u s 来命名一些菌种 在1 9 7 7 年 又被改为 r h o d o c h r o u s 复合群 这些菌与诺卡氏菌 棒杆菌和分枝杆菌很相似 是 种好氧的 诺卡菌形放线菌 革兰氏阳性 无运动性 含分枝菌酸 1 诺卡氏菌形是一种形态描述 是指断裂菌丝体生长成短杆形或球形 红球菌在自然界中分布很广泛 它可以从土壤 岩石 岩洞 地下水 海底淤泥 动 物尸体 昆虫 油库或患病的动植物中分离得到 近年来人们逐渐认识到红球菌广泛的 经济价值 例如合成表面活性剂 絮凝剂 氨基酸及聚合物等许多化学物质 此外 红球 菌能够引起许多动物 植物 人类的疾病 这成为红球菌引起人们广泛的重视的又一个重 要的原因 7 最近 随着分类技术的不断完善 使得红球菌属的分类有很大改变 一些菌种被归为 其它菌属中 又有一些新发现的菌株被命名为红球菌 第九版 伯杰氏细菌鉴定手册 列 举了现有的1 2 种确立的红球菌种 它们是 嗜粪红球菌 尺 c o p r o p h i l u s 马红球菌 r e q u i 藤黄红球菌 r f a s c i a n s 红平红球菌 月 e r y t h r o p o l 球状红球菌 r g l o b e r n l u s 海 生红球菌 r m a r i n o n a s c e n s 混浊红球菌 r o p a c u s r p e r c o l a t u s 椿象红球菌 r r h o d n i i 玫瑰红红球菌 r r h o d o c h r o u s 赤红球菌 r r u b e r 和佐氏红球菌 r z o p f i l 4 2 红球菌的应用 4 2 1 红球菌对化学污染物的生物降解和生物除污 红球菌能够降解烃类物质及其它有害化学物质 并且常常用于生物除污 h i o r e m e d i a t i o n w a r h u r s t 等人指出 红球菌降解污染物的能力非常强 即使在饥饿状态 下也不会因为碳源的改变而影响对污染物的降解 由于细胞壁中分枝菌酸的脂键而使红球 菌细胞疏水 这有利于菌体接触有机物 并在油水界面降解疏水的污染物 许多研究者 相继对红球菌和相关微生物进行了生物除污的研究 b r i g l i a 用氯酚红红球菌肋d 如c o c c 觚 南开大学硕士毕业 学位 论文 第一部分前言 c h l d r o p h e m l i c u s 现在被重新分类为分枝杆菌 大大提高了p c p 的降解率m 1 c h r i s r o f i 发 现rr b p 可以提高被原油污染土壤的烃降解菌的数量m 1 k o r o n e l l i 报道在人工制造的污 染土中加入烃降解菌r e r y t h r o p o l 打可以大大提高烃降解率 红球菌可以降解许多化学污 染物 有简单的烃类 烃的氧化氯代物 芳香烃或含氮芳香物如p c b s p o l y c h l o r i n a t e d b i p h e n 0 1 等等 3 重金属离子 包括放射性金属的积累是另一种环境污染源 红球菌在除去废物尤其是 聚合物中的重金属方面起着重要作用 t o m i o k a 1 9 9 4 发现两种红球菌株可积累铯离子 从而减少了污染 4 2 2 生物表活剂和生物絮凝剂 红球菌在生物降解过程中产生生物表活剂 生物表活剂既有疏水集团也有亲水集团 并且存在于油水界面上 生物表活剂在生物降解污染物中有3 个方面的作用 第一 细胞 表面物质如枝菌酸使红球菌在两相界质中亲油而疏水 第二 表面活性剂能减少界面张力 而使有机物易进入微生物细胞 第三 细胞外表活剂分散疏水物质烃而提高了生物攻击液 滴时的表面积 据报道 红球菌产生的表活剂比现存的有机合成的表活剂更有助于生物降 解 同时能大大降低原油生物除污 柴油回收再利用 以及提高石油采收率的成本并且生 物表活剂的毒性较小 进一步研究红球菌表活剂的结构有利于提高其产量 目前研究的最多的菌株是r e r y t h r o p o l i s 它能产海藻糖腊类表活剂 r t u b e r 可产生槐糖脂类表活剂 r p e r c o l a f u s 可以产许多胞外表活剂 大大提高石油采收率 红球菌r