微生物技术复习.doc

微生物技术一、显微技术微生物类群及代表微生物1、 非细胞微生物：病毒 2、原核微生物：细菌、放线菌 3、真核微生物：酵母菌、霉菌微生物的个体和群体形态特征1、 细菌：小而突起或大而扁平 2、酵母菌：大而突起 3、放线菌：小而紧密 4、霉菌：大而疏松或大而致密细菌的特殊结构及其生理功能1、荚膜：（1）保护细胞免受干燥的影响，对一些致病菌来说，则可保护它们免受宿主细胞的吞噬 （2）是细胞外碳源和能源的贮藏物质，当营养缺乏时可被利用 （3）具有生物吸附作用，在污水生物处理中有利于污染物在细菌表面的吸附 （4）是细菌分类鉴定的依据之一2、鞭毛：鞭毛的数目和着生方式是细菌分类的重要依据3、线毛：不具有运动功能，但与菌的致病性吸附、传递遗传物质等有关4、芽孢：无繁殖功能，能否形成芽孢，芽孢的大小、形状以及在菌体中的位置，是细胞分类的重要依据放线菌和霉菌的菌丝种类1、 放线菌：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝2、 霉菌：无隔菌丝、有隔菌丝显微镜使用注意事项1、 取出显微镜时应一手提镜臂另一手托镜座。2、 拿显微镜时应让显微镜直立防止目镜脱落。3、 调整物镜时应转动物镜转换器。4、 观察玻片时应使物镜与玻片接近，距离约0.5cm处，开放光圈下降聚光器。5、 显微镜用毕后把聚光镜降下，将物镜转成八字形，载物台降到最低。将各部分还原。微生物大小测定方法实验书 43二、微生物制片与染色技术革兰氏染色的操作流程、所用主要试剂、染色结果操作流程：涂片、干燥、固定、染色（初染、媒染、脱色、复染）、干燥、镜检主要试剂：结晶紫染液，卢戈氏碘液、95%乙醇，番红染液染色结果：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色革兰氏染色的原理：一般认为革兰氏染色过程中，细菌细胞内形成了一种不溶性的蓝紫色结晶紫-碘的复合物，这种复合物可被乙醇从革兰氏阴性菌中浸出，但不易从革兰氏阳性菌中浸出。革兰氏染色关键步骤、染色结果分析关键步骤是脱色以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌常常由于脱色不完全而呈假阳性三、清洗包扎与消毒灭菌技术依据微生物生长对氧气的需求不同，微生物的分类和各类型的特点（1） 专性好氧微生物：必须在有氧条件下生长，有完整的呼吸链，以氧气为最终电子受体，细胞内含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。多数细菌和大多数真菌属于（2） 兼性好氧微生物：在有氧和无氧条件下都能生长，但在这两种情况下代谢途径并不相同，它们在有氧的时候进行有氧呼吸，在无氧情况下进行酵解或无氧呼吸，其产物也各不相同。这类微生物细胞内也含有SOD和过氧化氢酶。（3） 微好氧微生物：在有氧和绝对无氧条件下均不能生长，只能在较低的氧分压下生活。（4） 专性厌氧微生物：不能利用氧气，氧气的存在对它们的生存能造成损害，即使短时接触空气，生长也会被抑制甚至致死。专性厌氧微生物经过酵解、无氧呼吸或循环光合磷酸化等获取能量。细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺少过氧化氢酶。（5） 耐氧微生物：不能利用氧气，但氧气的存在对他们无害，它们没有呼吸链，只能通过酵解获取能量，细胞内存在过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。常见的消毒灭菌方法和各自的适用范围，能正确选择 1、高压灭菌 （1）高压蒸汽灭菌法：适用于各类耐热物品，如培养基、工作服、生理盐水等的灭菌(2) 干热灭菌法：对于一些玻璃器皿、金属用具等耐热物品(3) 煮沸消毒：即将待消毒物品，如注射器、金属用具、解剖用具等(4) 间隙灭菌法：对于某些培养基，由于高压灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌法灭菌(5) 巴氏消毒法：是用较低温度处理牛奶、酒类等饮料2、 辐射灭菌 3、过滤除菌 4、高渗作用 5、干燥 6、超声波高压蒸汽灭菌技术与干热灭菌技术的适用范围、设备、参数、步骤、注意事项（1） 高压蒸汽灭菌法：适用于各类耐热物品，如培养基、工作服、生理盐水等 的灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅参数：121度下处理20-30分钟步骤：(1)加水:立式锅加水至锅内底部隔板以下三分之二高处 （2）装锅：把需灭菌的器物放入锅内（器物不要装得太满，以免影响灭菌效果），盖好锅盖，将螺旋柄拧紧(对角式均匀拧紧）打开排气阀。（3） 启动开关 （4） 排放冷空气：在排气持续两分钟后关闭排气阀（5） 升压 、保压与灭菌：关闭排气阀后，当压力达到0.1MPa，温度为121度时，开始灭菌计时，控制热源，维持0.1MPa，温度为121度30分钟完成灭菌。（6） 降压与排气：完成灭菌后停止加热，任灭菌锅自然冷却降压，当压力降至0.025MPa以下后，打开排气阀排除余汽。切勿过早打开排气阀，否则因压力突降，培养基会剧烈沸腾，既损失培养基又污染棉塞。（7） 出锅：待锅内压力降至大气压时揭开锅盖，取出器物。注意事项：高压蒸汽灭菌锅 适用于培养基、生理盐水、各种缓冲液、玻璃器皿、工作服；加水；冷空气彻底排除；保压；压力降为0时访客开盖；不同培养基的灭菌条件有所区别。(6) 干热灭菌法：对于一些玻璃器皿、金属用具等耐热物品设备：干热灭菌箱，恒温鼓风干燥箱参数：160度维持2小时，170度维持1-1.5小时步骤：（1）进箱：物品放在铁搁板上，关箱门 （2）定温：常用灭菌温度为160度或170度 （3）灭菌：接通电源，升温至定温灭菌，160度维持2小时，170度维持1-1.5小时 （4）出箱：关断电源，待温度降至50度左右，开箱门取出被灭菌物品注意事项：（1）灭菌时，温度不宜超过170度，以免易燃物，如棉塞、包扎纸等被烧焦（2）高温时，切勿开箱门，以免冷空气骤然进入使灭菌的玻璃器皿炸裂。（3）绝不允许先将温度上升到100度以上再放器皿，以免玻璃器皿骤然在高温下炸裂（4）温度降至80度以下才可打开烘箱门，以免温度过高造成烫伤。四、培养基制备与分装技术依据微生物对碳源及能源的需求不同，微生物的分类及各类型的特点1、 光能自养型：这是一类能以二氧化碳为唯一碳源或主要碳源并利用光能进行生长的微生物，它们能以水、硫化氢，硫代硫酸钠等还原态无机物，使二氧化碳固定还原成细胞物质。2、 光能异养型：这类微生物利用简单有机物作为主要碳源和供氢体进行光合作用，合成细胞有机物质。它们不能在完全无机的环境中生长。在有有机物存在的前提下，它们也能固定二氧化碳。3、 化能自养型：利用无机物氧化过程中放出的化学能作为它们生长所需的能量，以二氧化碳或碳酸盐作为唯一或主要的碳源进行生长，利用电子供体如氢气、硫化氢、二价铁离子或亚硝酸盐等使二氧化碳还原成细胞物质。4、 化能异养型：这类微生物生长所需的能量来自有机物氧化过程放出的化学能，生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等，也即化能有机营养型微生物里的有机物通常既是它们生长的碳源物质又是能源物质。培养基配制原则和流程原则：(1)选择适宜的营养物质:根据不同微生物的营养需要，配制不同的培养基 （2）营养物质浓度及配比合适 （3）控制PH条件流程：计算、称量、加热溶解、定容、调PH值、包扎、灭菌常用的培养基和培养对象1、 牛肉膏蛋白胨培养基：细菌2、 高氏1号培养基：放线菌3、 YEPD培养基：霉菌、酵母菌微生物对营养的吸收方式单纯扩散、促进扩散、主动运输、基团移位五、微生物接种、分离纯化与培养技术微生物的常用分离纯化技术种类分离：涂布法、平板划线法、倾注法纯化：平板划线法六、微生物菌株保藏技术菌种保藏的原理 菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌种创造一个有利于它们长期休眠的良好环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等），使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠的状态，而在一定时间内得到保存。菌种保藏的常用方法，及其适用范围、优缺点书108七、微生物生长量测定技术微生物生长的测定方法及其特点。一、 直接计数法：1、计数器直接计数法:快速简便但所得结果是死菌和活菌的总数。2、比浊法：简便、但使用有局限性。3、称重法：直接而有可靠，但要求测定时菌体浓度较高，样品中不含杂质。4、菌丝长度测定法。5、平板菌落计数：可以反映出样品中活菌的数量，要求菌体呈分散状态，否则无法确定单个菌落是否由单个细胞形成。6、薄膜过滤技术法：可以反映出样品中活菌的数量，此法适用于测定量大含菌浓度很低的流体样品。二、 间接计数法。血球计数板的结构和使用方法。结构：特制的载玻片有4条沟和两条嵴中央有一短横沟和2个平台，两条嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央1mm2面积上刻有400个小方格。生长曲线表示方法。以培养时间为横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线。单细胞微生物典型生长曲线的阶段划分，及其各阶段特点与实践意义？1 延滞期 不繁殖，细胞数目不增加；合成代谢活跃，细胞重量及体积明显增加；对不良条件抵抗能力降低。2 指数生长期 生长速率常数最大；菌体的大小、形态、生理特征比较一致；酶系活跃，代谢旺盛；活菌数和总菌数接近。实践意义：常用指数生长期的菌体作为种子，缩短延滞期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。指数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等微生物基本特性的极好材料。3 稳定生长期 活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平；细菌代谢物积累达到最高峰；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；有的微生物在稳定期时开始合成抗生素等此生代谢产物。4 衰亡期 细菌出现多形态、大小不等的畸形、衰退型