第四章 植物组织培养的基本方法.doc

第四章 植物组织培养的基本方法v 外植体的选择v 外植体灭菌方法v 外植体接种，培养v 培养物污染原因和预防措施v 外植体褐变及其防止v 玻璃化现象及其预防 第一节 外植体选择v 1、外植体部位 不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应不一致v 2、取材季节大多数植物，应在生长开始的季节采样v 3、器官或组织的生理状态，发育年龄 幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力v 4、材料大小 茎尖培养中，外植体越小成活率越高外植体的两种类型： A.带芽的外植体如茎尖和侧芽 B.分化的组织：茎段，叶，根，花瓣等v 第二节 外植体灭菌方法 要去除材料上的微生物，又不能伤及材料。1、 常用灭菌剂： 既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解。 应当正确选择消毒剂的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡。 一些表面消毒剂的消毒效果。 乙醇（70%75%）、次氯酸钠溶液（0.5%10%）、升汞（0.1%1%）、抗生素类杀菌剂等。外植体消毒步骤如下：v 取外植体 自来水冲洗 70%酒精表面消毒30s后无菌水冲洗 消毒剂处理（在消毒液中加入几滴表面活性剂） 无菌水冲洗干净 备用v 一般可将材料冲洗干净后，放入70%酒精中数秒，用无菌水冲洗后再放入升汞（110min）或次氯酸钠中（530min）消毒。再用无菌水反复冲洗四、五遍，可达到灭菌目的。v 不同植物不同部位都有各自的特点，即使同样的植物组织，由于栽培条件或季节不同，污染情况也不同。灭菌方式也有所差异。可参照相似植物的灭菌或是通过实验得到最适灭菌方式。v 1. 外植体表面灭菌v 从室外带回来的材料除去一些不必要的部分洗去泥土然后用皂液或洗衣粉及消洗灵浸泡，冲洗，必要时可用软刷刷洗材料，然后剪成适宜的大小，再行深灭菌。通过表面灭菌可清除许多杂菌，如在马蹄莲根茎的离体培养中，通过清洗根茎外植体的泥土，剥去外面几层包庇物，流水冲洗1小时，可把杂菌清洗掉60左右（Merel LG, 1998）。v 外植体的深灭菌 通过外植体表面灭菌后，仍有一部分杂菌存在于材料表面或内部，必须经过更深层次的的灭菌处理如加消毒药剂、抗生素、水浴、灼烧等措施才能获得不带菌的外植体。下面是几种典型外植体的深灭菌处理程序。v 茎段、腋芽、叶等的深灭菌 v 经表面灭菌后依材料的不同用70乙醇浸泡几秒一几十秒无菌水冲洗1次一2次再用01HgCl2灭菌3分钟一15分钟，最后用无菌水冲洗3次一6次。必要时，还要进行二次灭菌或多次灭菌。已经证明，二次灭菌或多次灭菌对某些种类的外值体很有效。另外不同消毒药剂使用浓度和消毒时间各异，效果也可能不同。如用NaClO和Ca(ClO)2的浓度大多是1一2和8一10，时间是5分钟30分钟不等。在这些过程中，有时还加一些表面活化剂吐温20或吐温80。通过这些步骤，基本上能把这类外植体的污染率降低到可接受的范围。v 球茎、块茎、种子等材料的深灭菌 这些材料的灭菌可先通过水浴处理，然后再用NaClO或HgCl2等杀菌剂灭菌。当然，并不是所有的外植体都能用水浴来进行灭菌，能水浴的外植体与很多因素有关，如材料的大小、湿度、材料的生理状态、包裹物的厚度、生长期的温度条件、材料上的潜伏水平、年龄等，同时，不同的材料要求的水浴温度和水浴时间的长短极不一致。药百合在水温42下水浴1小时污染可由40一60降到5（谭文澄等，1991）。而种子，情况极不一致：小麦种子可在55热水中保温3分钟一5分钟，而马占相思的种子则可在100下保持1分钟（朱广廉，1996）。经过水浴灭菌处理，可杀死一部分微生物，再经过化学杀菌处理即可达到灭菌的目的。v 荚果的深灭菌 v 将清洗后的荚果转入95乙醇中，然后取出荚果放入灭菌的培养皿中，点燃灼烧，并不断翻转荚果，待表面燃尽即可获得无菌荚果，再在无菌条件下取出幼胚或种子用于接种。火焰灭菌具有简便、快速、经济、彻底之优点。v 高温高湿环境中生长的外植体或易感染病毒的外植体的深灭菌处理 v 因这类外植体不仅表面滋生大量的微生物，而且一些菌丝体侵入表皮内的薄壁组织表面灭菌和用乙醇杀菌后，通常还加一种或几种杀真菌剂或抗菌素，最后再用化学杀菌剂处理。如在肾蕨幼嫩茎的灭菌处理中，因其表面密布锥形披针形鳞片，用常规的消毒处理不易彻底，因此，借助一些辅助手段，如加05NaCl和抗生素处理能达到很好的效果。 第三节 外植体接种 1、接种室消毒 用酒精擦拭台面，喷雾降尘，接种工具摆放好后用紫外线照射表面灭菌。2、外植体接种 在超净工作台上进行无菌操作，将外植体接种与培养基上。 接种时放置交叉污染。第四节 培养v 1、培养方法v （1）固体培养，简单 但由于我外植体只有底部表面接触培养基，因此各部分对养分吸收不均。另外，由于气体交换、代谢产物积累及光照等，导致细胞群生长不一致。（2）液体培养v 静止培养 滤纸桥培养v 振荡培养 磁力搅拌器、摇床、自旋式培养架2、培养条件温度 用该植物的最室温度湿度 培养室的温度应保持70%-80%光照 光强、光质和光周期PH值 选择最适的培养基PH值氧及其他气体5 培养物污染原因和预防措施v 1、污染： 在组培过程中，由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量的菌斑，是培养材料不能正常生长和发育的现象。v 污染物的长期存在会引起试管苗生活力下降，叶片缺绿，甚至死亡。v 2、污染主要原因:v 培养基及各种使用器具消毒不彻底，外植体灭菌时不彻底，操作时人为因素带入，工作区域污染3、主要从以下几个方面进行污染的控制 器具灭菌 接种用的器具除了经过高温消毒外，在接种的过程中，还需要经常蘸酒精红藕在酒精等火焰上彻底灼烧灭菌。 外植体 对采用田间外植体需进行与培养以减少材料带菌程度。（经灭菌的材料，并不一定完全将微生物杀死，有相当多的材料仍是带菌的，这些个体在培养几天后就开始长菌，需要及时进行检查和淘汰，否则还会传染其他个体。）对材料内带菌的外植体，应在培养基中加入抗生素。接种操作 首先，首要认真清洗，并用75%酒精进行消毒，在接种的过程中，还要经常用酒精擦手。 其次，对于需几代培养的培养物，在放入超净工作台前要用酒精擦拭瓶壁，以免瓶子上的大量微生物随气流在操作区内流动盘旋。同时在操作区内，不要放入过多的待用培养基，避免气流被挡住。 还有，接种者应熟练掌握操作技术，做到操作娴熟、干练。 环境条件 大环境的污染会使各个环节的污染明显加重，严重时使生产无法进行。环境要进行定期的消毒。 超净工作台 对操作台面用75%酒精进行消毒，在每次使用前应提前15-20min打开机器预处理。6 外植体褐变及其防止1、定义：外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以及培养基逐渐变成褐色，外植体也变褐二死亡的现象2、原因： 很多植物都含有较多的酚类化合u，这些酚类化合物在完整组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在细胞受到伤害是，分隔效应被打破，酚类化合物外溢，与多酚氧化酶接触，而氧化成褐色的醌类物质和水，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞。3、影响褐变的因素： 植物的种类和基因型 木本植物、单宁或色素含量高的植物容易发生褐变。 外植体的来源和生理状况 幼龄材料一般比成龄材料褐变轻（幼龄材料酚类化合物含量少）；同一职务冬春季取材褐变死亡率最低，其他季节取材则不同程度的增加（植物体内酚类含量和多分氧化物活性有季节性变化）。 外植体大小 小的材料更易发生褐变，相对较大的材料则褐变较轻。 切口越大，褐变越严重。除机械伤外，各种消毒用的化学试剂对外植体的伤害也会引起褐化。 培养基 站在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高可引酚类化合物的大量产生，导致外植体褐变。液体培养基可有效克服外植体褐变。 光 照 采取外植体前，如果将材料或母株 进行遮光处理，然后再切取外植体，能有效一直褐化。无光抑制褐化 原理是由于在氧化过程中，许多反应受酶系统控制，而酶系统活性受光照影响。 温度 高温促进酚氧化，而低温一直酚类化合物氧化，降低多酚氧化酶活性，从而减轻褐化。4、控制褐变措施 外植体和培养材料进行20-40天的遮光处理或培养，可以减轻一些种类的褐化程度。 在接种之前用无菌水反复清洗外植体并对外植体进行冷藏处理，洗尽切口处渗出的酚类物质，可起到减轻褐化的作用。 用抗氧化剂溶液对外植体进行预处理，或者在抗氧化剂溶液中切割。剥离外植体，可防止褐变的发生。 控制温度和光照 在不影响正常生长和分化的前提下，尽量降低温度，减少光照。 在培养基中加入一些抗氧化物和其他抑制剂，如盐酸半胱氨酸，抗坏血酸，硫代硫酸钠或柠檬酸等。 在培养基中加入0.5%-1%的活性炭，用以吸附褐变产生的有害物质，从而减轻褐变。 将培养物不断转移到新鲜培养基上，以消除有害物质的危害。7、玻璃化1、定义 当植物材料进行离体繁殖时，有些培养基的嫩茎、叶片往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。2、玻璃化苗的特点 叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。3、玻璃化的诱因 激素浓度 高浓度的细胞分裂素有利于促进芽的分化，也会使玻璃化的发生比例提高。细胞分裂素与生长素的比例失调，细胞分裂素的含量显著高于两者之间的适宜鼻孔里，是组培苗正常生长所需的激素水平失衡，导致玻璃化的产生。 温度 温度主要影响苗的生长速度，温度升高时，苗的生长速度明显加快，高温达到一定限度后，会对正常生长和代谢产生不良影响，促进玻璃化的产生。 湿度 瓶内湿度与同期条件密切相关，使用有通气孔的膜或通气较好的滤纸、牛皮纸封口时，玻璃化发生率减少。如果用瓶盖、不透气的封口膜、锡箔纸封口时，不利于气体交换，瓶子内处于不透气的高温条件下，苗的生长势快，玻璃化的发生频率相对较高。 培养基的硬度 随琼脂浓度的增加，玻璃化的比例明显较少，但过多时培养基太硬，影响养分的吸收，是苗的生长速度减慢。 光照时间 增加光照强度可以促进光合作用、提