手性药物合成中的生物转化.pdf

生物工程进展 2 0 0 0 Vo l 2 0 No 4 陈 鲤 造 杨 秀 北京生物 技术和新医药产业促进 中心 京1 0 0 0 3 5 秦 玉 静 中 国 科 学 院 化 辜 京 1 0 0 0 8 0 Q 3 2 摘要 目前手性药物的发展非常迅速 本文介 绍了利用微生物厦 其酶 系作为生物催化 剂 进行 外消 旋底 物的拆 分或前手性 底物 的不 对称 化 以合 成 手 牲 药物 的 生 物 转化 方 法 井评 述 了生物 转化 在 合 成手性 药物这 一领 域的应 用现状厦 夸 后的发展 趋 势 关 键 词 耋 堑 盐 些 乏 苎 竺 生物转化 亦称为生物催化 是指运用生物的方 法合成有机化合物或重要的中问体 现代生物转化 研究一般认为始于巴斯德时代 但工业化生物转化 最重 要的里程 碑应 该 是二 十世 纪 5 0年代 利 用 微 生 物对 甾体化 合 物的结 构 改造 1 P e t e r s o n等 人利 用 黑根 霉 Rh i z o l ms n i g r i c a n s 中 的 羟 化 酶 高 产 率 地 在孕酮 分 子 中 引 入 1 1 a O H 又 利 用 紫 罗 兰 梨 头 霉 T i e g h e me l l a o r c h i d i s 中 的羟 化 酶在 氢化 可 的松 前 体 R S A 中引 入 1 l 8 O H 这 些 生 物 酶促 特 异性 转 化 反应 为 甾体药 物 的合 成奠 定 了基 础 此 后 一些 重 要生物技术的发展导致 了有些传统 的化学反应工艺 被由生物催化剂催化的生物转化反应所代替 生物 转 化在有机 合成 中已得到越 来越广 泛 的应 用 生物 转 化具有 一些 化学 方 法无 可 比拟 的优 点 反 应 条件 比较温 和 产 物 比较 单 一 具 有 很 高 的 立 体 选 择 性 En a n t i c e l e c t i v i t y 区 域 选 择 性 Re g i o s e 1 e c t i v i t y 和化学选 择 性 C h e mo s e l e c t i v i t y 并 且能 完成 一 些 化学合成难 以进行 的反应 目前 生物转化已涉及 羟基 化 环 氧化 脱 氢 氢 化 等 氧化 还 原 反应 水 解 水合 醑化 酯 转移 脱水 脱羧 酰化 胺化 异构化 和芳构化 等各 类化 学反应 2 5 J 手性 C h i r a l i t y 是 自然 界 的本 质 属性 之 一 构 成 生命有 机体 的分 子都 是 不 对 称 的手 性 分 子 生 命 界 中普 遍存 在 的糖 为 D型 氨基 酸 为 L 型 蛋 白质 和 DN A 的螺旋构 象 又都是右 旋 的 手性 药物 C h i r a l d r u g 是指 有药理 活性作 用 的对映 纯 化 合物 生 命体内许多内源性化合物 包括可与药物发生药动 学和药效学相互作用的天然大分子都具有手性 不 同手性 的药物 作用 于 生物 体 时 它们 所 起 的作 用是 6 0 不同的 在活性 代谢过程及毒性等方面往往存在显 著差异 二十世纪 5 0年代 中期 臭名昭著的 反应 停 T h a l i d o mi d e 沙 利度 胺 作 为 镇 静 剂 用 于 消 除 孕 妇早期妊 娠反 应 但 不久 就 发 现 服用 此 药 的 孕 妇 生出 的婴儿 出现 畸 形 经研 究 发 现 具 有镇 静 作 用 的 是 R 一 对映体 而致畸作用是由 s 一 对映体 引起的 囡此必须 把具 有手 性的药 物的 另一 异构 体看作 是不 同的化合物 进行分别 检测 美 国食品和药 品管理 局 F DA 从 1 9 9 2年 起 要 求 申报 药 物 时 对每 一 个 异 构 体 的作用叙述 清楚 据 F 1 A调 查 手 性 药物可 形 成超过 2 0 0亿美元的高技术产业 到 2 0 0 0年将有 3 5 的合成药 物 以手 性 药物 的形式 上市 在化 学工 业 中 生 物 转化 主 要用 于 生产 光 活性 或手性 的小 分子 它们 或是药 物产 品 或是药 物 中间 体 随着生 物 技 术 和 现 代 提 取 分 离 鉴 定 手 段 的进 步 生物 转化也 被用 于 生产 如抗 体 和铪 疗性 蛋 白等 大分 子 生 物转化 已广 泛应用 于药 物前 体化 合物 的 转化 生 物催 化 的不 对称 合成 光 活性 化 合物 的拆分 等领域 合成手性药物的生物转化反应大致可分为 两类 一 类是把 外 消旋 体 拆 分 为 两个 光 活性 的对 映 体 另 一类是 从外 消旋或 前手 性 的前 体 出发 通过催 化反应 得到不 对称 的光 活性 产物 1 酶法拆分外消旋体台成手性药物 近 年来随 着酶 技 术 的 发展 利 用 酶 的高 度 立体 选择性进 行外 消旋体 的拆 分从 而获得 光 活性纯 的化 合 物是得 到 手性 药 物 的 重 要 途 径 酶 是 由 L 一 氨 基 酸组成 其活性 中 Ii 构成 了一个 不对称 环境 有利 于 对 消旋体 的识 4 属 于高度 手性 的催 化 剂 催 化效率 1 厂 v 一 维普资讯 高 有 很强 的专 一性 反 应产 物 的对映体过 量 百分率 e e 可达 1 0 0 因此 在手 性 药 物 合成 过 程 中 用 酶拆分 消旋 体是 理 想 的选 择 J n 苯 甘 氨 酸 和 n 对羟 基苯甘 氨酸 是生产 半合成 青霉 素和头 孢菌 类抗 生素 的重要侧 链 D S M 公 司 G e l e e n 荷 兰 利 用 恶臭 假单胞 菌 P s e u d o mo n a s p u t i d a 的 L 广 氨肽 酶拆 分 DL 氨基 酸酰 胺 获 得 了 D 苯甘 氨 酸 和 n 对羟 基 苯甘 氨酸 拆分 过程 中生成 的 不要 的对映体 可通过 与苯 甲醛 形成 酰胺 的 S c h i ff碱 形 成 加 合 物 在 升 高 p H值 时发 生外 消旋 化 外 消旋 后的氨 基酸酰 胺可重 复利 用 光学 活性 氰醇 以及 由它 转 变而 成 的 羟基 酸 n 羟基酯 n 羟 基 酮 和 8 羟 基胺 等 光 学 活 性 异构 体 都是重 要的医药和农药 中间体 8 类肾上腺素阻断 剂 拟除虫 菊酯 都是 这类化 合物 的代 表 氰基一 3 苯氧基 苯 甲醇 的 构 型 异构 体 具有 较 高 的 杀虫 剂 活性 当利用 节杆 菌 Ar t h r o b a c t e r 产 生 的脂 肪 酶 L i p a s e 对 氰 基 3 一 苯 氧 基 苯 甲醇 乙酸 酯 拆分 时 可得 到 构型氰 酸 e e 值 为 9 9 8 l l 如果想 成 功 地 提 供 药 物 中间 体 和 药 物 活 性 组 分 就必须 有供 选用 的大量 合成 平 台 生物催 化仅是 其中的一个方法 虽然产生一种现代的药物活性组 分 中通常 只有一 步是 采 用 生 物催 化 的 但 这 常常 是 把 手性引入 到化 合 物 中的 关 键一 步 并 且 由于药 物 结 构中 分子 手性部 分变得 越来 越重要 随着 分子 中 手性中心的增多 生物转化方法的 良好专 一性 和选 择 就必然要 比其它 手性 合成 方 法发展得 更快 2 利用完整细胞台成手性药物 一 般认 为 不 对 称合 成 是 合成 单 一手 性 中心 化 合物最好 的方 法 但 对于 具 有 多个 手 性 中心 的化 合 物 的合 成则倾 向于依 赖 生物 催 化 因此在 手性 药物 合 成时 更完美 但 更复 杂 的 过程 是 利 用整 个 细 胞进 行生物转 化 该 过 程不 但 可 以 引入 手性 而 且能 完 成 多步合成 由于 完 整细 胞 具 有 提 供 辅 酶 循 环 的 能 力 因此 可克服 在一 般纯酶 拆分 消旋体 中 一 个纯 的 光学 异构体 最 高收率 仅为 5 O 的局 限 1 1 具有 活泼 基 团 的 光 学 活 性 1 2 二 醇 可作 为手 性 中 间 俸 用 于 药 物 除 草 剂 等 的 合 成 Ha s e g a wa 等 研 究 发 现 用 类脱 发假 丝 酵母 d i d a p a r a p s i l o s i s 与 3 0 g L外 消旋 1 2 戊 二醇 反 应 可以得到 2 7 9 g L S 一 1 2 戊二 醇 收率为 9 3 其 对映体过 量值 e e 为 1 0 0 这 一 反 应首 先 由 R 1 2 一 戊二酵 经 N AD 一 偶 联 的 专 一 R 醇脱 氢 酶氧 化 为 1 一 羟 基 2 戊 酮 然 后 由 N AD P H 偶 联 的 专 一 S 2 酮一 1 一 醇还原 酶还原 1 一 羟基一 2 一 戊 酮为 S 一 1 2 一 戊二醇 这一立体控制合成反应正是利用微生物完 整细胞中的多酶体 系及其辅酶共同完成专一性拆分 外 消旋体 的过程 利 用上 述 方 法 还 制备 了 8种 光 学纯的 s 1 2 二醇化合物及 R 一 3 一 甲硫基一 1 2 一 丙 二醇 生物界 中存在的蛋白质和多肽基 本上都是 L 一 氨基酸 构成 的 而 由 n 氨 基酸 构成 的蛋 白质 和 多肽 不易 被生物 降解 因此 D 氨基 酸 可被 用 于合 成 口 一 内 酰胺类 抗生 素 和 生 理 活性 肽 7 J n 氨 基 酸 不 能 象 L 氨基酸那 样 由微 生 物 发 酵法 获 得 而是 用 化学 法 合成 DL消旋体 氨基 酸 再用 化学 方法 进行 拆 分 分 离 出 n 氨 基 酸 但 工 艺 复 杂 成 本 较 高 U me mu r r a 等 1 6 利用假丝酵母 C a n d i d a 的不对称 降解特性 由 DL 广 丙氨 酸 D L Al a 生产 制 备 D A a 在 4 O小 时内 2 0 0 g L D L A a中的 L 广 A a完 全 被降 解 剩下 不能降解 的 D Al a可 以 很 容 易 地分 离 出来 最 终得到 9 0 g 9 9 0 化 学 纯 和 g 9 9 9 光 学 纯 的 n Al a 3 生物转化台成手性药物的其它方法 3 L 有 机相 中的生物转 化 一 般 的生 物转 化 反 应都 是 在 水相 中进 行 的 而 有机合 成大 多是 在 有机 相 中进行 近年 来 随着 许 多微生 物酶 可 以在 有机相 中进 行具 有高 度立体选 择 性 和 区域选 择性 反 应 这一 特 性 的 发 现 在 有机 相 中 进行 生物 转化 的研 究 报道 越来越 多 1 7 1 9 脂肪 酶是 专 门 在 异相 系统 即在 油 水 的 界 面 上 起催 化作用 的酶 它在 水 中 只 能催 化 酯基 的水 解 反 应 而在有 机 溶 剂 中 可 以催 化 酯化 转 酯 等 多种 反 应 具 有较高 的稳 定 性 和 区域 立 体 选 择性 因此 它 是 人们研究 得最 多 的在有机 相中进 行 生物转 化 的酶 类之 一 S 一 氰 醇 是 合 成 拟 除 虫 菊 酯 的 重 要 中 间 体 I n a g a k i 等 将 脂 肪 酶 催 化 的 酯 交 换 反 应 和外 消旋化 作用 有机地结 合起 来 提 出了 酶催 化 的二级 不对称转 化 有效地 解 决 了纯 对 映体 产率 不 高 且 随转化率的提高产率反而降低的问题 在无水异丙 醚 中 利用洋葱假单胞菌 P s e u d o m 0 d c e p a c 的 脂 肪酶将 一个外 消旋 氰 醇转化为 单一 构型 的氰醇 乙 酸酯 产物的 e e 值高达 9 1 收率最高为 9 6 3 2 生物催 化 剂的 固定 化 把酶或细 胞等 生物催 化 剂 固定 在某些疏 水性 载 体上或包在载体内 能使 生物催化剂在有机溶剂中 6 维普资讯 发挥 更高 的催 化效 率 并且 对有 机溶 剂 引 起 的酶 变 性抗性 显著 增 强 目前 常 用 于 固定 化 的疏 水性 载 体材料 有 氨基 甲酸 乙荫 树脂 微 孔陶瓷 有机硅 材料 聚硅 氧烷 硅 藻土等 等 光 学 活 性 布 洛 芬 B u mp r o f e n 和 萘 普 生 Na p r o x e n 是 一类 2 一 芳 基 丙 酸 的衍 生 物 是 重要 的 非 甾体 抗 炎药 其 中 S 构 型具 有很 高 的生 理 活性 或 药 理 作 用 而 R 构 型 的 活 性 很 低 或 无 活 性 S 一 萘普 生活性 为 R 一 萘 普 生的 2 8倍 布 洛芬 S 构 型的活性 是其 R 掏 型 的 1 6 0倍 将 圆柱 状 假 丝 酵母 C c y l i n d r a c e a 脂 肪 酶 吸附 在 弱 极性 Atub e r l i t a X A D一 7树脂 上 制成 固定 化制 剂后 填 充于 柱式 反 应器 中拆 分 萘普 生 酯 连 续操 作 1 2 0 0小 时后 可 以得 到光 学 纯 的 S 一 萘 普 生 e e 9 5 而 酶话 力 仅 下降 2 0 L R一 硝 基醇 是具 有 两种 官 能 团 的手 性 合成 原 可 用 于合成 具有 抗病毒 抗 真菌 抗肿瘤 等生 物活性 的 药物 Na k a mu T a等L 利 用硅藻 土 将 圆柱状 假 丝酵 母 C c y l i n d r a c e a 固定化后 在正 乙烷中催化外消 旋 4 一 硝基一 2 一 丁醇和 乙酸一 2 一 丙 烯 酯之 间的酯 基转 换 得 到 R 4 一 硝 基一 2 一 丁 醇 用 同 样 方 法 还 合 成 了 R 一 5 硝 基一 2 一 戊 醇 两 种 R一 硝 基 醇 的光 学 纯度 均 超 过 9 5 3 3 酶的体外定 向进化 酶是人 类迄 今为 止所知 道 的最高 效 和最 具选择 性的 生物催 化剂 但 天然 酶 在 有 机溶 剂 中易 变性 失 话的弱点 使酶 的应用受到了很大的限制 近年来 发展起来的酶的体外定 向进化技术 d i r e c t e d e v o l u t i o n o f e n z y me i n v i t m 属 于 蛋 白质 的非 合理 设计 i r r a t i o n a l d e i g n 它 不 需 要 事 先 了 解 酶 的催 化机制 和空 间结 构 通过 人为 地创 造条件 模 拟 自然 进化机制 随机突变 重组 和自然选择 在细胞体外 改造酶基 因 并 定 向选 择 出所 需 性 质 的 突变 酶 酶 的体 外定 向进 化 是对 酶进 行 修饰 的 最新 方 法 它 不 仅能使酶演化出非天然特性 还能定 向进化某一代 谢 途径 而且可 以改 善酶 的 稳 定性 底物 特 异 性 对 映体选择性等 并在抗体库 D NA结 合位点定向进 化 抗辐 射性等 方 面也有 广泛 的应 用 极大 地拓展 了 蛋 白质 工程学 的研究 范 围 为指 导应 用 如 药物设计 等 奠定 了理论 基础L 2 7 3 罗拉碳头孢 L o r a c a r b e f 是第 四代头 孢菌素类 抗 生素 具有半 衰期 长 抗菌 谱 广和 耐受 8 一 内酰胺 酶 水解的特 点 枯草 芽孢 杆 菌 B a c i l l u s s b t i t i s 酯 酶 可水解 此 头 孢 菌 素 母 核 中 的 对 硝 基 苄 基 保 护 基 6 2 C h e n等人 2 8 运 用定 向 进化 技 术 将 酯酶 基 因经 过 四轮随机 突变和一步 D NA片段体外 重组 后 对其 序列测定 分 析 确定 了突 变 位 点 成 功 地 得 到 了 在 3 0 二 甲基 甲酰 胺 DMF 溶 液 中具 有 高效 水 解 活 性 的新 酯酶 使 表 现活性 提高 近 6 0倍 利 用微生 物及 其酶 系作为催 化 剂实 现有机 合成 的生 物转化和 合成 方法 将成 为 2 1世纪 有机化 学和 生物技术的新结合点 一些新 技术和方法如抗体 酶 反胶 柬 酶 交 联酶 晶体 等 的 发展 及 完 善 生 物转 化和 组合化 学 的结合 也 推 动 了生物 合 成 和 生 物转 化在制 备手性 药 物 中的应用 目前 能被 用 于有机 合 成 中的生物催 化 剂仍是 撅少 数 随着 基 因工 程 蛋 白 质工程和工业微生物 的不断发展 生物转化在手性 药物合 成 中的应 用将会 更加 广泛 参 考文 献 1 Ki e s l i c h K i n Mic rob i a l E a a d B io c o n v e r s io n s A c a d e mi c P r e 鹃 Ne w Yo r k 1 9 8 0 f 2 Ma r g o l in A L E y me Mie r o b io l T e c h n o 1 9 9 3 5 4 2 6 6 l 3 J F a b e r K F r s s e n M R Tr e n d s i a B i o t e c h n o 1 1 9 9 3 1 1 4 6 l I 4 S t a n ie 1 o E F e r mb o s c h i P Gr i s e n t 1 P C h e m Re me w 1 9 9 2 9 2 5 1 07 1 5 F W D m B i o c a t aty s i s F r o m D i s mwr yt oAp p l i t i o n S p r i n ge r Pr I 9 9 9 f 6 G o d t f r e d n S E in B l t y m s i n O r g a n ic S y n t h e s I n t e r n a t io n a l S y mlx iu m 1 9 85 7 A r ms t r o n g D W G p e r M P L e e S H e t A mi n o A c id s 1 9 9 3 5 3 2 9 9 8 Ol iv ie r i R F a s c e t t i E An g d i n J L e t E n z y me Mie r i o l T h n o i 1 9 7 9 1 3 2 01 9 Mi mu d a S N a l s h ima S H J mh a r a H A p p l Mic r o b ic Bio t e c h n o l 1 9 8 9 3 1 3 3 4 I 1 0 Mi t s u dst S t Y a ma mo m H U me mu r a T e t A g n B in C h e m I 9 9 0 5 4 1 1 2 9 0 7 I 1 1 Ha s e g a wa J A g r i B i d C h e m 1 9 9 0 5 4 1 8 1 9 1 2 S a n t 0 n ie l b o E F e r r a b o h i P G r k e n t l P e t a l C h e m Re v 1 9 9 2 92 1 0 71 1 3 L e e I G e t at J Or g C h e m 1 9 8 6 5 1 2 5 1 4 J C a mb o u B a l J A m Ch e m s o c 1 9 8 4 1 0 6 2 6 8 7 1 5 Gr o t h U S e h o I k o p U Ch Y S y n t h e s i s 1 9 8 2 8 6 4 1 6 Ume mu m I t Y a n a g i y a K K o ma t s u b a r u S Ap p i Mi c mb i o l B i o t e d mo 1 1 9 9 2 3 6 6 7 2 2 Ll 7 1 O a s t o l i F R Mu s t o N A P 睫 S A r c h B i o c h e m o p h y s 1 9 9 6 1 1 5 4 4 1 8 D o r d i c k J S E n z y meMi c m i o l T h n o l 1 9 8 9 1 1 1 9 4 1 9 F imp a t c k P A K l b a n o v A M J Am Ch S e e 1 9 9 1 I1 3 3 1 6 6 2 0 J mg i M H i r a t a k e J J A m C h e m S o c 1 9 9 1 1 1 3 9 3 6 0 维普资讯 2 1 T r a mp e r J Tr e a d s i n B io t h n ol r 1 9 8 5 3 4 0 2 2 O r i e t P E y Mi c mb i o T h n o l 一 1 9 8 8 t 1 0 5 1 8 2 3 胁 t d E B i n c h i D C e s t i P e t a l B e 亡 h B i o 日 1 g 1 9 9 1 3 8 6 5 9 2 4 N a k a mu r a K m A g r t c B o l C h e m 1 9 9 0 5 4 1 5 6 9 2 5 Yo u L A r n o l d F H P rot e i n E n g t 1 9 9 6 9 7 7 2 6 2 Mo o r e J C A r n o l d F H Na t u r e B i o t e c h n o l 1 9 9 6 t 1 4 4 5 8 2 7 P 舟 n 曲 P A H o wa r d R J S t n me r t w P C c一0 n Bi o t e e h 1 9 9 7 8 7 24 2 8 Ch e K A rno ld F H P r o c N a t Ac a d s c j US A 1 9 9 3 9 0 56 1 8 Bi o t r a n s f o r ma t i o n i n Ch i r a l Dr a g s S y nt he s i s C h e n S h a o y i Ya n g Xi u B mt h P h ii t g 1 r Ig Qi n Yu j i n g I n s t i t u t e o f C h e mis t r y C h i n Ac a d e my o i S c ie n c D e i j i n g Ab s t r a c t B e c a u s e o f t h e i mp o r t a n c e o f c h i r a l d r u g s c o n s i d e r a b l e e f f o r t s h a v e b e e n ma d e i n d e v e l o p i n g b i o t r a n s f o r ma t i o n f o r t h e p r o d u c t i o n o f e h i r a d u g s Th i s a r t i c l e r e v i e ws t h e p r e p a r a t i o n o f o p t i c a l l y a c t i v e p r o d u c t s wh i c h a r e f o r me d b y r e s o l u t i o n o f r a c e mi c a nd a s y mme t r i z a t i o n o f p r o c h i r a l s u i t a b l e s u b s t r a t e s c a t a l y z e d b y mi c r o b i a l c e l l s o r e n z y me s Ke y wo r d s B o t r a n s f o rm a t i o n Ch i r a l d r u g s Re s o l u t i o n 接 第 6 6页 2 4 P a ul C h r M t 8 1 P r o N a t A c a d S c i US A 1 9 8 9 8 6 7 5 0 0 7 5 0 4 2 5 1 P d a r B e t P l a a t j o u r n s l 1 9 9 4 5 f 4 5 8 3 5 9 2 2 6 R e g i s t e r J c P a m Mo l e c u l a r B io l o g y I 9 9 4 2 5 9 5 1 9 6 2 7 s p e 吐盯TM P Mol u l a r 陆 k g 1 9 9 2 1 8 2 1 0 21 1 2 8 Umb e c k P e t C r o p S d e n c e 1 9 8 9 2 9 1 1 9 9 6 2 0 0 1 2 9 Va n B o k t a n dR p k n a t J 1 9 9 4 6 8 6 1