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PCR PolymeraseChainReaction 检验技术 第一节概述 一 何为PCR PCR聚合酶链反应英文全称polymerasechainreaction简称为PCR 第一节概述 二PCR的基本原理PCR聚合酶链反应实际上是一种快速的特定DNA片断在体外扩增技术 简单的说 DNA的特性三步曲 高温变性低温退火中温延伸通过一个热循环仪 DNA扩增仪 将特异片断的基因 DNA 又叫模板DNA 在短时间内 经过引物Taq酶和三磷酸脱氧核苷酸 dNTPs 等作用后 放大到几百万倍 最后得到能肉眼看到的DNA区带或可定量分析的DNA量 第一节概述 三简单复习一下DNA的结构与复制生命是由蛋白质合成的蛋白质是由无数氨基酸连接成肽链而合成的氨基酸则是由无数个基因即DNA组成的这就是说DNA是蛋白质的生命 第一节概述 DNA的基本构成单位 脱氧核糖 核苷酸 磷酸核苷酸有4种碱基 A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶 第一节概述 DNA的基本构成单位 C 胞嘧啶 G A 腺嘌呤 T T 胸腺嘧啶 A G 鸟嘌呤 C 脱氧核糖磷酸氢键 第一节概述 DNA的基本构成单位 在DNA结构中 4种碱基 以A T G C进行严格配对的 A T G C排列顺序的变化是无穷无尽的 人体中大约有30亿 3X109 DNA的基因组 碱基的顺序是DNA的生命 第一节概述 RNA与DNA的区别 RNA的核糖是不脱氧的五碳糖 RNA的4种碱基是A U G CA 腺嘌呤U 尿嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶U在DNA中对应的碱基是T 胸腺嘧啶 第一节概述 RNA与DNA的区别 核糖脱氧核糖 第一节概述 碱基以3个为1组 三联密码 DNAATGAAGAGT GTCCATCACTAAmRNAAUGAAGAGU GUCCAUCACUAA蛋白质甲硫氨酸赖氨酸丝氨酸缬氨酸组氨酸组氨酸无意义ATG AUG 起始密码 是转译的开始TAA UAA 终止密码 是使1条肽链的合成到此中止 CAT CAC 简并密码 是一种氨基酸 可以有多于CAU CAC 1个的三联密码 但也是特定的 第一节概述 DNA与蛋白质合成的关系用Watson和Crick的中心法则说明则是 转录翻译DNAmRNA蛋白质逆转录 第一节概述 DNA与蛋白质合成的关系先由在细胞核中的DNA 基因 的碱基以3个为一组 三联密码 转录成mRNA的三联密码mRNA来到细胞核外的核糖体 蛋白质合成的场所 上 且每一种三联密码指使一种特定的氨基酸同毗邻的氨基酸连接起来 变成了一种肽链 蛋白质 这个过程称为转译 如果合成的肽链很长的话 也可以形成立体结构的蛋白质 第一节概述 DNA的结构 DNA大分子以反向互补的两条单链形成双螺旋的立体结构 其形状多少有点象人们常见的小食品 麻花 第一节概述 DNA的复制半保留复制DNA的复制过程先是两个链分开 然后两条亲代链均以各自为模板 复制另一条互补链 之后再形成子1代的双螺旋结构 继之再以同样的方式复制成子2代 子3代 子4代 此时把这种复制方式称为半保留复制 第一节概述 基因突变 基因突变 也就是碱基的突变 例如 ATG编码是甲硫氨酸 但如果发生了基因突变 是ATG中的T变成了A 则三联密码变成了AAG 在新合成的蛋白质长链上与甲硫氨酸对应的位置上就只能是赖氨酸 而不再是甲硫氨酸了 这就是突变的本质 有时人体就因此发生病变 这也就是 突变 的主要实质 第一节概述 四扩增HBV C基因片断为例简述PCR原理HBV病毒是带有3182个碱基的双螺旋的双链DNA步骤1前处理2基因扩增3电泳4检测报告 第一节概述 基因扩增模板DNA HBV病毒 950C变性 使双链打开 变成两个单链 二个单链是实验成败的关键 550C退火 在合成原料dNTPs Mg2 的作用下 模板DNA与引物C构成二条杂交链 二条杂交链决定其实验的特异性 720C延伸 在Taq酶的作用下 以引物为起点 开始DNA链延伸反应 使链延长 形成一条新的链对实验的特异性和产量有关 生成二个特异性的DNA片断 完成了第一次循环 生成的二个特异性的DNA片断 继续进行下一次循环 经过25 30次循环 模板DNA得到了大量的复制 HBV C可扩增到几百万倍 第一节概述 理论上讲 DNA的产量是指数方式增加 即n次循环后 扩增产物拷贝数为r 2n但是应该指出 扩增产物的指数式增加不是无限制进行的 在PCR反应后期 由于引物和底物的消耗 Taq酶活力下降等因素的影响 扩增产物的增加逐渐由指数形式变为线性形式 所以实际上进行30个循环后 扩增倍数一般可达106 107 如果想提高扩增产物的产量 可将产物DNA样品稀释1000 10000倍后 作为新的模板再进行第二轮PCR扩增 第一节概述 PCR循环 Step1 热变性 第一节概述 PCR循环 Step2 引物对 PrimerPair 退火结合到靶序列 第一节概述 PCR循环 Step3 TaqDNA聚合酶催化引物延伸 第一节概述 第一个PCR循环结束 产生靶序列的两个拷贝 Copies 第一节概述 靶序列扩增 第一节概述 上述的扩增是在PCR扩增仪上进行的 然后将扩增产物经过EB电泳 最后在紫外透射仪上进行鉴定 定量分析 第一节概述 第一节概述 报告方式定性 PCRHBV DNA PCRHBV DNA 定量 PCRHBV DNA 1 00X103copies mlPCRHBV DNA 1 00X103copies ml 第一节概述 第一节概述 第一节概述 五PCR技术的特点 一 特异性高1 以探测基因为目标 属于 病因诊断 针对性强 对多种传染病 根据PCR检测结果可以确诊 2 在感染性疾病的基因诊断中 不仅可以检出正在生长的病原体 也可检出潜伏期的病原体 既可确定既往感染 也可确定现行感染 尤其对那些目前尚不能体外培养或难于培养的病原体 梅毒螺旋体 结核杆菌 乙肝病毒等 采用PCR检查来确定感染就特别有效 PCR检测的靶样品是病原体的核酸 与生物化学和免疫学检查相比 PCR结果与病原体分离培养结果更为一致 直接反应病原体的存在与否 第一节概述 二 灵敏度高在PCR扩增中 模板DNA以指数级迅速增加 样品中极其微量的靶序列在数小时内即可增加上百万倍 因此检测灵敏度高 ELISA 酶联免疫吸附试验 灵敏度高ngRIA 放射免疫分析 灵敏度高pgPCR 聚合酶链反应 灵敏度高fg理论上可检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在 可利用单一双倍体细胞 一根头发 甚至单一精子进行DNA定型 从而提高临床诊断的阳性率和准确率 第一节概述 三 简便快捷有了扩增仪 有了商品化试剂盒 操作者不必自配各种试剂 只需将样品作简单处理和加样后 仪器即可自动循环进行扩增 许多PCR检查现在在数小时左右即可出报告 第一节概述 四 对样品要求低 几乎所有的临床标本都可用于PCR扩增 甚至低温保存多年的陈旧标本 PCR检测病原微生物 并不要求标本中有存活的病原体 病原体虽然失活 只需有完整的靶序列核酸 PCR就可以检出来 一些过去靠脑脊液 脊髓检查的项目PCR以其高灵敏度和高特异性 从检查血 唾液或尿标本同样可以得到一致的结果 为标本采集带来方便 也使检测范围扩大和容易展开 第一节概述 五 PCR的局限性 由于Tag酶缺乏3 5 端的外切酶活性 因而不能纠正反应中发生的错误的核苷酸掺入 使PCR扩增产物有一定程度的错误掺入 但是错误掺入的碱基有终止链延伸作用的倾向 这使得发生了的错误不会进一步扩大 PCR由于高敏感性容易导致交叉扩增 在实验室污染的情况下可能出现假阳性结果 第一节概述 五 PCR的局限性 在引物针对范围过窄或存在抑制剂等影响下也可出现假阴性结果 PCR有优点也存在缺点 它是现有各种检验方法的一种补充而不是替代 尤其对一些生物化学 免疫学检验可以获得明确结果的情况下 就没有必要滥用PCR 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 一 病毒的检测1PCR检测人类巨细胞病毒 PCRHCMVDNA 标本采集 尿液 血液 口咽部标本 脑脊液 羊水 组织标本 石蜡切片等 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 1 PCRHCMVDNA 临床意义 HCMV属疱疹病毒科 是一种DNA病毒 本病的特征性病变是受感染细胞体积增大 胞核和胞浆内出现包涵体 此种病变细胞可见全身组织 器官 引起相应症状 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 1 PCRHCMVDNA 临床意义 HCMV感染后轻者 呈亚临床不显性感染 即隐性感染重者 在免疫功能低下者呈弥漫性病变 严重者甚至死亡 多见于器官移植而接受免疫抑制剂治疗 恶性肿瘤接受化疗后极易受HCMV的感染 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 孕期妇女由于内分泌及免疫状态的改变 约有7 7 10 2 的孕妇发生原发或继发感染 病毒通过胎盘 引起胎儿的先天性感染 可致流产 早产 死产 一般急性感染指标阳性的孕妇 若胎儿情况不佳 如胎心异常 胎儿腹水等 应立即终止孕娠 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 受HCMV感染的早产儿可出现全身感染综合症 即称为巨细胞包涵体病 CID 体征为全身皮肤剥脱 点状出血 肝脾肿大 黄疸 血小板减少 小头畸形 视力 听力障碍等 因此HCMV是引起人类先天畸形的重要原因之一 对社会的危害性很大 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 2PCR检测风疹病毒 PCRRVRNA 标本采集 血液 血浆 血清 羊水 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 2PCR检测风疹病毒 PCRRVRNA 临床意义 风疹病毒属于披膜病毒科 风疹病毒属 是RNA病毒 风疹又曾为德国麻疹 但较麻疹症状轻 合并症少 受风疹病毒感染的成人 其症状类似一般感冒 其不同点是患者颜面 躯干 四肢发生类似麻疹样的红斑丘疹 多在1 3天消退 预后良好 儿童少年期感染风疹症状比成人轻 甚至不显症状 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 2PCR检测风疹病毒 PCRRVRNA 临床意义 孕妇受风疹病毒感染后 可经血液通过胎盘侵犯胎儿 引起流产 死产 一般孕妇在四个月以前处于风疹病毒急性感染期 应立即终止妊娠 受风疹病毒感染的活产者大约有20 胎儿表现先天性风疹综合症 其表现 a 体重低于2500g且发育迟缓的低体重儿 b 出生后全身器官受损 导致畸形 视力 听力障碍 心血管系统异常等 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 3PCR检测单纯疱疹病毒 PCRHSVDNA 标本采集 疱疹液 溃疡底部的刮取物 唾液 结膜液 角膜刮取物 阴道棉拭子 宫颈分泌物 脑脊液 脑活检标本等 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 3PCR检测单纯疱疹病 PCRHSVDNA 临床意义 单纯疱疹病毒 HSV 为一种双链DNA病毒 有两个血清型HSV I主要侵犯腰部以上的部位 主要侵犯口 唇的皮肤黏膜 引起眼 面部的感染HSV II主要侵犯腰部以下的部位一般与外生殖系统感染和新生儿感染有关 如 引起生殖器疱疹男性 阴茎 包头 龟头的损害女性 子宫颈的病变近年来I II型合并感染为多见 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 3PCR检测单纯疱疹病 PCRHSVDNA 临床意义 孕妇感染HSV II后可经胎盘或生殖道上行感染引起胎儿宫内感染 其后果与HCMV RV TOX的先天感染相似 自然流产 早产 死产 一般孕妇若HSV II急性感染指标阳性者应终止妊娠 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 3PCR检测单纯疱疹病 PCRHSVDNA 临床意义 受HSV感染的婴儿 可为小头 脑钙化 小眼球患儿 或出生后4 5天发生发热 痉挛 呼吸困难 出血倾向 以致死亡 病死率高达90 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 4PCR检测人乳头瘤病毒 PCRHPVDNA 标本采集 宫颈分泌物 患者发病处的活组织及分泌物 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 4PCR检测人乳头瘤病毒 PCRHPVDNA 临床意义 是一种小的双链DNA病毒 可感染人的皮肤和粘膜上皮细胞 诱发细胞增生 产生乳头瘤样病变 能引起传染性很强的生殖器湿疣 该病是性传播疾病 女性患该病 病情严重时 可全身发臭 孕妇胎死腹中 引产困难 HPV与宫颈癌 喉癌 口腔癌等恶性肿瘤密切相关 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 5PCR检测EB病毒 PCREBDNA 标本采集 咽拭子 尿液 肺移植病人的肺组织等 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 5PCR检测EB病毒 PCREBDNA 临床意义 EB病毒属于疱疹病毒科 是双链DNA病毒 唾液传播是主要方式 偶尔可通过输血感染 引起淋巴瘤 鼻咽癌 传染性单核细胞增多症 与何杰金氏病 慢性疲劳综合症 CFS 器官移植后淋巴细胞增生症等有关 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 6PCR检测柯萨奇病毒 PCRCVBRNA 标本采集 血液 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 6PCR检测柯萨奇病毒 PCRCVBRNA 临床意义 柯萨奇病毒是属于小核糖核酸的肠道病毒 可引起广泛的骨骼肌肌炎和坏死 CVB主要引起心肌炎等疾病 并具有较高的发病率 尤其是婴幼儿感染后死亡率较高 所以早期诊断是有重要的临床意义 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 二 细菌的检测1PCR检测结核杆菌 PCRTBDNA 标本采集 痰 胸水 腹水 脑脊液 尿 淋巴结 胸膜活检组织 血液 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 1PCR检测结核杆菌 PCRTBDNA 临床意义 结核病的发病率在世界范围内都有回升 我国在中青年及老年两个年龄组出现发病高峰 用PCR检测结核杆菌可提高其阳性率和准确性 与直接涂片染色法相比 阳性率为40 50 若 1000条 阳性率仅4 PCR检测理论上可查出一个结核杆菌 达fg级量 且不受非致病菌性抗酸杆菌导致假阳性结果的干扰 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 1PCR检测结核杆菌 PCRTBDNA 临床意义 结核的早期诊断与结核杆菌的分纯培养相比结核杆菌为专性需氧菌 培养条件要求高 要在含有鸡蛋 甘油和土豆等丰富营养的培养基上生长 该菌生长缓慢 18小时才繁殖一代 故接种4 6周才会出现肉眼可见的菌落 因此靠培养结果达不到早期快速诊断的目的 在结核杆菌感染的早期 特别是结核病灶通过血源性传播时 在外周血中存在极少量的结核杆菌 PCR扩增就能给予确诊 因为早期菌血症是较易得到控制的 以防继发性结核病灶的形成 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 1PCR检测结核杆菌 PCRTBDNA 临床意义 鉴别诊断a 肺结核与肺癌的鉴别对于肺结核 特别是结核球和成人原发性肺结核等 经常易与肺癌诊断混淆 结核的中心部分经常出现坏死区 但既无结核杆菌 又未检到癌细胞 涂片染色也无抗酸菌 此时采用PCR检测就特别有效 因为PCR即可查能着色的活菌 也可查出不着色的死菌 只要该菌的DNA未破坏 就能检出 从而确诊病灶是良性还是恶性的 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 1PCR检测结核杆菌 PCRTBDNA 临床意义 b对于脑膜炎 胸膜炎 腹膜炎等形成的渗出液标本 用PCR检测有无结核杆菌的存在 可帮助寻找和确证病因 C用PCR检测尿液 精液标本中的结核杆菌DNA 可为肾结核 泌尿生殖系统结核的诊断提供检验依据 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 2PCR检测淋球菌 PCRNGDNA 标本采集 生殖泌尿道分泌物尿液及眼分泌物 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 2PCR检测淋球菌 PCRNGDNA 临床意义 人类是淋球菌唯一的自然宿主 为革兰氏阴性双球菌 是淋病的致病原 而淋病主要是由性接触而传染 淋球菌侵入泌尿生殖系统繁殖 男性发生尿道炎女性引起尿道炎和子宫颈炎未经治疗或治疗不彻底 可扩散至生殖系统 形成慢性感染 胎儿经产道时 在分娩过程中可被感染而患淋病性急性结膜炎 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 3PCR检测沙眼衣原体 PCRCTDNA 标本采集 生殖泌尿道分泌物尿液 眼部分泌物 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 2PCR检测沙眼衣原体 PCRCTDNA 临床意义 沙眼衣原体的感染率和危害性在性传播疾病中超过了淋球菌 它可引起非淋球菌性尿道炎 宫颈炎 子宫内膜炎 急性输卵管及盆腔炎 沙眼衣原体 引起性病淋巴肉芽肿变种 男性 侵犯腹股沟淋巴结 引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿 女性 可侵犯会阴 肛门 直肠 引起会阴 肛门 直肠组织狭窄 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 3PCR检测沙眼衣原体 PCRCTDNA 临床意义 可导致沙眼 成人和新生儿包涵体结膜炎 婴儿沙眼衣原体肺炎等 引起不育症 由子宫颈或子宫内膜反复地衣原体感染或因衣原体引起的精子免疫反应所致 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 4PCR检测解脲支原体 又称解脲脲原体 PCRUUDNA 标本采集 生殖泌尿道分泌物尿液 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 4PCR检测解脲支原体 PCRUUDNA 临床意义 导致非淋球菌性尿道炎 孕妇感染后 可发生如下并发症 妊娠早期 引起受精卵脱落和妊娠终止妊娠晚期 引起妊娠中毒症 羊水过多 早产 胎膜早破 死胎等分娩时 引起新生儿呼吸道感染 引起不育症 这可能是由于解脲支原体吸附于精子 阻碍其运动 或其所产生神经氨酸酶样物质 干扰精子与卵子的结合 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 5PCR检测肺炎支原体 PCRMPDNA 标本采集 咽拭子咽部分泌物鼻咽部分泌物 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 5PCR检测肺炎支原体 PCRMPDNA 临床意义 肺炎支原体是急性呼吸道感染和原发性非典型肺炎的病原体 尤其在儿童和青少年中常见 常在军营和中小学中流行 许多患者症状较轻 大多数不表现出任何症状 若有症状也只是头痛 发热 咳嗽等呼吸道症状 也有个别引起死亡的报道 该病原体在非细菌性肺炎和非病毒性肺中有较高的检出率 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 5PCR检测肺炎支原体 PCRMPDNA 临床意义 肺炎支原体除引起呼吸道感染外 还可发生呼吸道以外的并发症 如中耳炎 心血管症状 神经症状和皮疹等 这可能与免疫复合物形成及抗体的出现有关 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 5PCR检测肺炎支原体 PCRMPDNA 临床意义 肺炎支原体感染在治疗上与其它微生物感染不尽相同 为避免滥用抗生素 早期快速 准确的检测肺炎支原体 PCR法就是有实际的临床意义和流行病学意义 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 三 寄生虫的检测1PCR检测弓形虫 PCRTOXDNA 标本采集 抗凝血 羊水脑脊液 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 1PCR检测弓形虫 PCRTOXDNA 临床意义 弓形虫又称弓浆虫或毒浆虫 是一种能寄生于造血组织中的原虫 弓形虫的滋养体形态呈新月形故名弓形体或弓形虫 弓形虫为人畜共患的病原体 时下养猫狗等宠物之风盛行 因此也就造成了认得感染率提高 第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断 1PCR检测弓形虫 PCRTOXDNA 临床意义 成人感染可因感染轻 无症状 但血中可查到抗体 感染重时 可引起各种症状 如高热 肌肉关节疼痛 肺炎 心肌炎或传染性单核细胞增多症等