wwthe 小麦抗秆锈病基因sr22 的ssr 新标记guide download.pdf

中国农业科学 2010 43 15 3244 3250 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2010 15 024 收稿日期 2010 04 08 接受日期 2010 05 05 基金项目 国家 十一五 科技支撑计划课题 2006BAD08A05 农业部 948 项目 2006 G2 公益性行业 农业 科研专项 200903035 作者简介 韩建东 助理研究员 博士 E mail hanjiandong16 通信作者曹远银 研究员 博士 E mail caoyy66 小麦抗秆锈病基因Sr22的 SSR 新标记 韩建东 1 2 朱桂清1 李伟华1 曹远银1 1沈阳农业大学植物免疫研究所 沈阳 110161 2山东省农业科学院土壤肥料研究所 济南 250100 摘要 目的 利用微卫星技术筛选与Sr22紧密连锁的标记 从而应用于分子辅助育种选择与抗性种质基因 检测分析 方法 以抗秆锈病单基因系 SWSr22 与感病品种 McN701 为亲本杂交获得 F1 单粒 F1种子自交获得 F2 群体 选用中国流行小麦秆锈菌小种 21C3CTH 接种鉴定 进行遗传分析 利用分离群体集群分析法 BSA 对位于 7A 染色体的 73 对 SSR 引物进行多态性筛选 具有多态性的引物再通过 SWSr22 McN701 的 F2抗感群体与 F2 3家系 的植株进行验证 结果 该单基因系 SWSr22 对 21C3CTH 的抗性属于单位点显性遗传 并筛选到 2 对在亲本及 F2 抗感群体间揭示多态性的 SSR 引物 Xwmc790 和 Xwmc633 通过对 F2分离群体的分析表明 这 2 个标记与抗病基因 Sr22紧密连锁 呈共显性 分布于该基因的同一侧 位于远着丝点处 与Sr22的遗传距离分别为 2 8 cM 和 10 8 cM 结论 这 2 个标记与抗病基因Sr22紧密连锁 经验证可用于小麦抗秆锈病分子标记辅助育种 关键词 小麦 秆锈病 SSR Sr22 分子标记 New SSR Markers for Stem Rust Resistance Gene Sr22 in Wheat HAN Jian dong1 2 ZHU Gui qing1 LI Wei hua1 CAO Yuan yin1 1Institute of Plant Immunology Shenyang Agricultural University Shenyang 110161 2Institute of Soil and Fertilizer Shandong Academy of Agricultural Sciences Jinan 250100 Abstract Objective The microsatellite markers closely linked to Sr22 were screened to be used in marker assisted selection for breeding and gene detection diagnose for resistant germplasm and varieties Method A population of F2 plants was generated from one F1 plant derived from a cross between susceptible wheat cultivar McN701 and wheat monogenic line SWSr22 and seedlings of parents and F2 plants were inoculated for genetic analysis In addition parental DNA and bulked segregant analysis BSA were used to screen for polymorphism with 73 SSR markers that covered the chromosome 7A of wheat The markers showing DNA polymorphism were validated by F2 population and F2 3 family of SWSr22 McN701 Result The resistance to 21C3CTH must be the gene contained in monogenic line SWSr22 and was controlled by a single dominance Two co dominant markers Xwmc790 and Xwmc633 were identified and mapped on the distant side of centromere with distances of 2 8 cM and 10 8 cM respectively Conclusion The two markers were tightly linked with Sr22 and could be used in marker assisted selection of Sr22 for breeding Key words wheat stem rust SSR Sr22 molecular marker 0 引言 研究意义 小麦秆锈病 Puccinia graminis f sp tritici 是对小麦生产极具破坏性的病害之一 在大多 数小麦种植国家和地区都出现过毁灭性的流行 1 1999 年在乌干达首次发现了对小麦抗秆锈病基因 Sr31 有强毒力的秆锈菌新小种 Ug99 TTKSK 2 该小种一直快速地向东和东北方向蔓延 2006 年覆盖 了埃塞俄比亚 苏丹以及阿拉伯的也门等大多数国家 和地区 2007 年就已传入伊朗 3 按此趋势 Ug99 将很可能会随盛行的由西向东的高空气流侵入中国 4 目前 笔者所在的实验室正在密切监测之中 5 博罗格 全球锈病研究协作组织 Borlaug Global Rust Initiative BGRI 6 提出了通过培育多抗性品种达到对小麦秆锈 15 期 韩建东等 小麦抗秆锈病基因 Sr22 的 SSR 新标记 3245 病持久控制的策略 利用与抗病基因连锁的分子标记 对抗病后代 品种 进行选择 使培育聚合多个抗病 基因的新品种变得相对容易 7 这也会为 Ug99 入侵前 较快培育出抗病新品种提供一种新手段 前人研究 进展 经鉴定 截至 2009 年正式定名 46 个小麦秆锈 病基因对不同的小种具有抗性 8 目前用于抗病基因 的分子标记技术主要包括 RFLP AFLP RAPD SSR RGAP 和 DArT 等 并且许多被转化成方便使用的 SCAR CAPS STS 等标记 获得的标记与目标基因 连锁程度越来越紧密 近 40 年 由于对小麦秆锈病全 球性的持续控制 通过分子标记获得的抗秆锈病基因 相对较少 已获得的抗病基因主要有 Sr2 9 Sr5 10 Sr6 11 Sr9a 7 Sr9e 10 Sr22 12 13 Sr24 14 Sr25 15 Sr26 14 Sr31 16 Sr36 6 Sr38 17 Sr39 18 Sr1A 1R 19 20 和 SrR 21 等 Paull 等 12 获得了 2 个与 Sr22 紧密连锁 的 RFLP 标记 Khan 等 13 利用 SSR 技术筛选到了 2 个紧密连锁的微卫星标记 Xcfa2019 和 Xcfa2123 遗 传距离分别为 5 9 cM 和 6 0 cM 本研究切入点 Sr22 不仅对 Ug99 具有抗性 22 而且对中国大多数小麦秆 锈菌小种也表现良好的抗性 23 然而中国国内未见抗 秆锈病基因分子标记的报道 拟解决的关键问题 本研究利用7A染色体上的SSR引物筛选与Sr22更加 紧密连锁的标记 将更准确 更有效地对抗病基因进 行检测 为抗病育种实现分子辅助选择提供可靠保证 1 材料与方法 1 1 供试材料 抗病亲本单基因系 SWSr22 兼抗 Ug99 与中国国 内秆锈小种 感病亲本 McN701 及其杂交的 F2分离 群体 供试小麦秆锈菌生理小种为 21C3CTH 高度感 染 McN701 以上材料均由沈阳农业大学植物免疫 研究所提供和保存 1 2 苗期抗秆锈性鉴定 接种小麦秆锈菌生理小种 21C3CTH 在苗期对亲 本 SWSr22 McN701 和 SWSr22 McN701 F2群体 进行抗秆锈性鉴定 采用涂抹法接种 黑暗保湿 16 h 后放于玻璃温室内培养 大约接种后 15 d 即发病充 分后 按照 Roelfs 24 的标准记载侵染型 通过卡方测 验法进行拟合检验 1 3 小麦基因组 DNA 的提取 PCR 反应和变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳 采集新鲜的小麦叶片 参照 Aldrich 等 25 的 CTAB 法提取小麦基因组 DNA 用紫外分光光度计测定样品 的浓度 A260nm A280nm 1 8 2 0 用 0 8 琼脂糖凝胶 电泳检测 DNA 样品的纯度 根据 R der 等 26 和 http wheat pw usda gov 已报 道的微卫星引物序列 选取位于小麦染色体 7A 上的 73 对 SSR 引物进行筛选 引物由上海生工生物工程技 术服务有限公司合成 扩增反应体系为 25 L 含 10 buffer 含 Mg2 2 5 L 10 mmol L 1的 dNTPs 0 5 L 5 mol L 1的引物 1 L 5 U L 1的 Taq 酶 0 2 L 30 ng L 1的模板 DNA 2 L 反应条件 94 预变性 5 min 94 变性 50 s 50 60 退火温度依引物而 定 复性 60 s 72 延伸 90 s 35 个循环 72 延伸 10 min 4 保存 扩增循环在 Hybaid Limited PCR 仪 内进行 取8 L甲酰胺凝胶载样缓冲液与PCR产物混合 95 变性 5 min 后 置于冰上冷却 将 6 变性聚丙烯 酰胺凝胶在 75W 恒功率下预电泳 30 min 上样 保持 恒功率 75W 电泳时间 0 5 3 h 视扩增片段长度和 同源片段间相差大小而定 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 银染显色分析参照 Bassam 等 27 的方法进行 观察照 相 1 4 遗传连锁分析 在F2中随机选择10份抗病单株DNA等量混合建 立抗病池 10 份感病单株 DNA 等量混合建立感病池 利用 Michelmore等 28 的 BSA 法快速筛选与 Sr22 连锁 的标记 然后对 142 株 F2分离群体进行多态性分析 用 Mapmake 3 0 软件计算扩增位点和目的基因的遗传 距离 用 Mapdraw 软件绘制连锁图谱 1 5 F2 3家系的验证 在 McN701 SWSr22 F2分离群体中随机选出 20 个单株繁殖 F2 3家系 包括 15 个抗病单株和 5 个感病 单株 接种 21C3CTH 后 进行抗性鉴定 推断 F2单 株的基因型 分析 F2抗性鉴定结果的准确性 结合 SSR 分析结果验证筛选标记对 F2 3家系分子辅助选择 的准确性 1 6 差异片段的回收 再扩增及序列测定 所得的特异性片段采用聚丙烯酰胺凝胶回收试剂 盒回收 然后利用原引物及原程序对回收产物进行扩 增 将 PCR 纯化产物与载体连接 转化 所得阳性克 隆送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测 序 2 结果 2 1 亲本和 F2分离群体的抗性鉴定结果及遗传分析 3246 中 国 农 业 科 学 43 卷 抗病亲本单基因系 SWSr22 对小麦秆锈菌生理小 种 21C3CTH 表现抗性侵染型 1 感病亲本 McN701 表现感病侵染型 4 Fl对 21C3CTH 全部表现抗病 侵 染型为 1 与 SWSr22 的侵染型相同 接种 21C3CTH 的 262 株 F2单株中 192 株表现抗病 70 株表现感病 遗传学分析结果表明 F2群体的抗感比符合 3 1 分 离模式 2 3 1 0 326 20 05 1 3 84 表明单基 因系 SWSr22 对 21C3CTH 的抗性是由 1 对显性基因 控制的 2 2 分子标记的筛选和遗传连锁分析 通过 BSA 法 在位于染色体 7A 上的 73 对 SSR 引物中 鉴定到 2 对引物 Xwmc790 和 Xwmc633 的扩 增产物表现多态性 选出 142 株 SWSr22 McN701 的 F2群体 用这 2 对引物分别扩增并进行电泳分析 结果表明 它们都能在大多数抗病单株中扩增出 A 型 带 H 型带 在大多数感病单株中扩增出 B 型带 图 1 呈共显性 能够有效的区分杂合单株和纯合单株 说明这 2 个扩增位点与抗病基因 Sr22 紧密连锁 利用 3 0 的琼脂糖凝胶电泳检测 2 对引物在抗感亲本中 的扩增产物即能区分开 图 2 PR 抗病亲本 PS 感病亲本 R 纯合抗病株 S 纯合感病株 H 杂合抗病株 PR Resistant parent PS Susceptible parent R Resistant F2 progeny S Susceptible F2 progeny H Heterozygous F2 progeny 图 1 2 个 SSR 标记 A Xwmc790 和 B Xwmc633 的聚丙烯酰胺凝胶电泳 Fig 1 Polyacrylamide gel electrophoresis of the two SSR markers A Xwmc790 and B Xwmc633 M DL1500 R SWSr22 S McN701 图 2 引物 Xwmc790 和 Xwmc633 的琼脂糖凝胶电泳检测 Fig 2 The PCR products of the microsatellite markers Xwmc790 and Xwmc633 detected in AGE F2单株的 SSR 标记引物扩增带型统计见表 1 引 物 Xwmc790 和 Xwmc633 在抗病亲本和抗病 F2单株 中分别扩增得到 110 bp 和 230 bp 左右的特异条带 其 中 Xwmc633 扩增到的抗感特异条带与 http wheat pw usda gov 报道的 149 bp 相差较大 利用软件 Mapmake 3 0 对扩增结果进行连锁分析 结果表明 表 1 SWSr22 McN701 F2植株抗秆锈性与 SSR 标记带型关 系 Table 1 Relationship between resistance and SSR phenotypes of F2 plants of SWSr22 McN701 引物 Primers Xwmc790 Xwmc633 SSR 标记带型 SSR phenotypes A H B A H B 抗病单株 Resistant plants 36 68 3 38 59 10 感病单株 Susceptible plants 0 0 35 1 3 31 A 纯合抗病带 B 纯合感病带 H 杂合带 A Homozygous for resistant parent s allele B Homozygous for susceptible parent s allele H Heterozygous 15 期 韩建东等 小麦抗秆锈病基因 Sr22 的 SSR 新标记 3247 这 2 个扩增位点与基因 Sr22 存在紧密连锁关系 遗传 距离分别为 2 8 cM 和 10 8 cM 图 3 2 3 McN701 SWSr22 F2 3家系验证结果 由表 2 可以看出 来自 15 个抗病 F2单株的 F2 3 家系经接种鉴定 有 11 个 F2 3家系出现了抗感单株的 分离 表明它们对应的 F2单株携带杂合抗病基因 其 余 4 个 F2 3家系全部表现抗病 说明它们对应的 F2单 株携带纯合抗病基因 来自 5 个感病 F2单株的 F2 3家 系全部表现感病反应 说明它们对应的 F2单株携带纯 合感病基因 以上分析进一步证明 F2单株鉴定结果的 准确性 将推断获得的 20 个 F2 3单株的基因型与引物 Xwmc790 和 Xwmc633 在这 20 个 F2单株中扩增的 DNA 条带类型结果基本吻合 引物 Xwmc790 在 3 号 F2单株中扩增的条带类型与其基因型不符 说明这个 F2单株是一个在抗病基因和扩增位点间发生了交换的 个体 引物 Xwmc633 在 3 9 和 17 号 F2单株中扩增 图 3 抗病基因Sr22的遗传图谱 Fig 3 Linkage map of resistance gene Sr22 表 2 20 株 McN701 SWSr22 F2 3家系的抗性鉴定和分子检测结果 Table 2 Resistance reaction and detection of SSR markers in 20 plants of McN701 SWSr22 F2 3 families F2 3抗性表型 Phenotypes of F2 3 families分子检测带型 Fragments given by SSR markers单株 Plant F2抗性表型 Phenotype of F2 population R S F2基因型 Genotypes of F2 population Xwmc790 Xwmc633 1 R 8 3 Rr H H 2 R 7 3 Rr H H 3 R 8 3 Rr A A 4 R 10 0 RR A A 5 R 9 3 Rr H H 6 R 7 2 Rr H H 7 R 11 0 RR A A 8 R 10 4 Rr H H 9 R 7 3 Rr H B 10 R 9 4 Rr H H 11 R 12 0 RR A A 12 R 12 0 RR A A 13 R 8 4 Rr H H 14 R 10 3 Rr H H 15 R 9 3 Rr H H 16 S 0 12 rr B B 17 S 0 10 rr B H 18 S 0 10 rr B B 19 S 0 11 rr B B 20 S 0 12 rr B B R 抗病 S 感病 RR 表现抗性反应的纯合基因型 Rr 表现抗性反应的杂合基因型 rr 表现感病反应的纯合基因型 A 纯合抗病带 B 纯 合感病带 H 杂合带 R Resistant S Susceptible RR Homozygous genotype for resistance Rr Heterozygous genotype for resistance rr Homozygous genotype for susceptibility A Homozygous for resistant parent s allele B Homozygous for susceptible parent s allele H Heterozygous 3248 中 国 农 业 科 学 43 卷 的条带类型虽与其基因型不符 但其余 17 个均与抗性 鉴定结果相吻合 以上说明这 2 个标记可以在抗病育 种中用于对抗秆锈病基因 Sr22 的分子辅助选择 2 4 特异性片段的回收和测序 对引物 Xwmc790 在 SWSr22 中扩增得到的特异 条带回收 以其为模版 按原始的 PCR 条件进行扩增 经琼脂糖凝胶检测表明 扩增的片段大小与以亲本为 模版扩增获得的片段大小一致 克隆测序后该序列长 度为 105 bp 含有的微卫星序列为 GC 6 GA 20 图 4 引物序列如下 正引物序列 5 AATTAAGATAGAC CGTCCATATCATCCA 3 反引物序列 5 CGACA ACGTACGCGCC 3 1 AATTAAGATAGACCGTCCATATCATCCATGCGGGCGCGCGCGCGCGAGAGAGA 54 GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTATGGCGCGTACGTTGTCG 图 4 SSR 引物 Xwmc790 扩增得到的 DNA 序列 Fig 4 The sequence of the specific band amplified with microsatellite marker Xwmc790 3 讨论 迄今为止 已经发现了数十个小麦抗秆锈病基因 并且多数已在染色体上定位 其中绝大部分抗病基因 具有小种专化性 尽管单基因抗性容易被快速进化的 小种克服 但利用抗病品种仍不失为防治小麦秆锈病 最经济有效的良策 29 其中保持持久抗性的策略之一 就是将多个抗秆锈病基因聚合到同一小麦品种中 使 病原菌难以克服其抗性 30 通过常规育种手段对于导 入单个抗病基因是很有效的 但存在鉴定周期长 受 环境条件影响大 操作繁琐等缺点 而且导入多个抗 病基因时 由于受鉴别小种的限制和基因间的掩盖 不能准确鉴定出导入的是何种抗病基因及抗病基因的 数量 导致在选择过程中抗病基因的丢失 相反 利 用与抗性基因紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助 选择 可提高育种选择效率和准确性 且在育种的早 期阶段便可实现对多个抗病基因的检测 目前应用于抗病基因分子标记的方法主要有 RAPD RFLP AFLP SSR RGAP 和 DArT 等 其 中基于 PCR 技术的 SSR 标记在普通小麦中具有多态 性高 标记共显性 技术简便 快速 稳定性高 等 位基因多样性的特点 在小麦抗病基因的精细定位 抗性基因聚合 分子辅助育种和分子检测中应用越来 越广泛 自 R der 等 26 成功构建了小麦的第一张 SSR 图谱以来 至今已建立了多个小麦微卫星图谱 极大 丰富了小麦的遗传图谱 为小麦重要性状的分子标记 与作图建立了很好的技术平台 最近 国外研究学者 利用SSR技术筛选到了与小麦抗秆锈病基因Sr6 Sr9a 和 Sr36 等紧密连锁和完全连锁的分子标记 为小麦抗 秆锈病育种奠定了基础 抗病基因 Sr22 对小麦秆锈菌表现为中等程度以 上抗性 在不同的小麦遗传背景下其侵染型可能有所 不同 兼抗新小种 Ug99 和中国大多数小麦秆锈菌生 理小种 与其它抗病基因一起使用可实现小麦的持久抗 性 Sr22 最早在野生一粒小麦 Triticum boeoticum G 21 31 和栽培一粒小麦 Triticum monococcum LRL5244 32 中被发现 通过杂交转移到普通六倍体小 麦 单体分析表明 Sr22 位于小麦染色体 7AL 上 33 遗传学和病理学试验表明 源自 Triticum boeoticum 和 Triticum monococcum 的六倍体小麦含有相同的小麦 抗秆锈病基因 33 34 本研究选用 7A 染色体上的 73 对 SSR 引物共筛选到 2 个与 Sr22 紧密连锁的分子标记 Xwmc790 和 Xwmc633 并绘制了遗传连锁图 其顺 序与 Somers 等 35 报道的物理图谱基本一致 小麦在长期的进化和选择过程中 染色体会发生 重组 而且 2 个遗传位点之间遗传距离越远 发生重 组的可能性就越大 筛选到的标记要与目的基因紧密 连锁 最好完全连锁 这样发生伴随遗传的可能性越 大 因此还需对筛选标记的可靠性进行验证 以前有 的验证仅用了 F2群体 但在研究中发现用变异性大的 F2 3家系进一步验证其可靠性和稳定性则更为关键 如果要验证标记是否具有诊断性 在不同遗传背景的 材料中检测抗病基因的有无 在验证材料中还需加 入不同遗传背景的已知含有该抗病基因和不含该基因 的小麦品种 系 即使某个分子标记不具有对抗病 基因的诊断性 这些标记也可以在分子辅助育种中加 以利用 但前提是亲本间能扩增出差异的标记带 并 且其中一个亲本含有目的抗病基因 4 结论 选用小麦 7A 染色体上的 73 对 SSR 引物 通过对 SWSr22 McN701 F2群体和 F2 3家系的分析验证 获 15 期 韩建东等 小麦抗秆锈病基因 Sr22 的 SSR 新标记 3249 得 2 个与 Sr22 紧密连锁的呈共显性的分子标记 Xwmc790 和 Xwmc633 位于 Sr22 的同侧 远着丝点 端 遗传距离分别为 2 8 cM 和 10 8 cM 可用于今后 抗病育种的辅助选择 References 1 Knott D R The Wheat Rust Breeding for Resistance New York Springer Verlag Berlin Heidelberg 1989 201 2 Pretorius Z A Singh R P Wagoire W W Payne T S Detection of virulence to wheat stem rust resistance gene Sr31 in Puccinia graminis f sp tritici in Uganda Plant Disease 2000 84 203 3 Nazari K Mafi M Yahyaoui A Singh R P Park R F Detection of wheat stem rust Puccina graminis f sp tritici race TTKSK Ug99 in Iran Plant Disease 2009 93 317 4 曹远银 韩建东 朱桂清 张 璐 小麦秆锈菌新小种 Ug99 及其 对我国的影响分析 植物保护 2007 33 6 86 89 Cao Y Y Han J D Zhu G Q Zhang L Ug99 a new virulent race of Puccinia graminis f sp tritici and its effect on China Plant Protection 2007 33 6 86 89 in Chinese 5 韩建东 曹远银 孙仲桂 2007 2008 年我国小麦秆锈菌小种种群 结构及其对 Ug99 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