常见植物组.ppt

第九章常见植物组织培养 第一节蔬菜组织培养第二节果树组织培养第四节农作物组织培养第三节花卉植物组织培养 第一节蔬菜组织培养 草莓组织培养大蒜组织培养 草莓组织培养 一 草莓脱毒苗的培育 一 脱毒技术 二 脱毒苗的检测二 草莓无病毒苗的繁殖和利用1 防止蚜虫的危害2 程序及提高繁殖率的措施3 生产管理工作 草莓为重要的浆果植物 草莓属多年生草本植物 用匍匐茎繁殖和分株法繁殖 保持了母本的优良性状 但是长期无性繁殖易积累多种病毒 导致品种退化 产量和品质下降 草莓经济危害严重的病毒主要有4种 即草莓斑驳病毒 SMYEV 草莓皱缩病毒 SCrV 草莓镶嵌病毒 SVBV 和草莓轻型黄边病毒 SMYEV 这些病毒主要有蚜虫传播引起的 脱毒技术 1 茎尖培养脱毒2 热处理和茎尖培养相结合脱毒3 花药培养 1 茎尖培养脱毒 在匍匐茎发生最多的季节 6 8月 剪取5cm左右的顶梢 剪去叶片 自来水冲洗干净 70 的酒精浸蘸3 5s 0 1 0 2 的氯化汞或6 8 的次氯酸钠灭菌2 10min 无菌水冲洗3 4次后 剥去茎尖外面的幼叶和鳞片 露出生长点 切取带有1 2个叶原基 0 3 0 5mm 的茎尖用于接种 1 取材和消毒 2 接种和培养 3 生根和驯化 初代培养可在MS 6 BA0 5 IBA0 2 GA0 1中进行 分化培养和繁殖培养基可用MS 6 BA0 5 1 0 培养条件为 温度25 30 光 1500 2000lx 每天光照10h pH5 8 6 0 培养20d后开始分化成丛生芽 生根培养 1 2MS为基本培养基 除去6 BA 只附加生长素 使用范围为IAA0 5 1 0mg L或IBA0 2 1 0mg L 炼苗 试管苗根长2 3cm时 将瓶盖除去 在温室里放置3 4天进行锻炼 移栽及驯化 锻炼后将苗从瓶中取出 洗去基部培养基 移栽到盛有营养土或蛭石的塑料钵内 再加塑料薄膜拱棚保湿 保持相对湿度85 以上 温度22 25 7 10d后 试管苗长出新叶 发出新根 可逐渐将小拱棚揭开 经过驯化20 30d的试管苗可移栽到大田 2 热处理和茎尖培养相结合脱毒 1 材料准备定植后1 2个月 根系生长健壮的盆栽草莓苗 最好带有成熟的老叶 以增加对高温的抵抗力 2 热处理将盆栽小苗或试管苗放入人工气候箱中 每天在40 下处理16h 在35 下处理8h 变温处理4 5周可达到脱毒的目的 草莓植株耐热性差 常用茎尖试管苗进行热处理 3 花药培养 取材 单核期的花蕾 直径约为4mm 置于内有湿润滤纸的洁净培养皿中保湿 放入3 4 冰箱中低温保存3 4d后 在70 酒精中浸泡半分钟 取出放入新配制的饱和漂白粉上清夜中消毒10min 用无菌水冲洗3次 然后在超净工作台上剥取花药 立即接种 花粉发育时期可采用醋酸洋红压片鉴定 培养基为MS 2 4 D0 4 IAA2 去分化阶段培养条件为24 26 光照10h d 1500lx 20d后可产生乳白色的愈伤组织 1 取材与培养 2 植株分化 将诱导出的花药愈伤组织转移1 2基本培养基 添加GA0 5 BA0 5和三十烷醇4 愈伤组织经培养后很快转绿 以后微带淡紫红色 15d后在表面分化出半球形小突起 转为绿色 20d后分化出幼叶 幼茎 并有不少突起物 以后陆续分化出新梢 检测方法主要有指示植物小叶嫁接鉴定法和电子显微镜鉴定法 草莓的病毒在通过汁液接种不感染 所以通常采用小叶嫁接法来进行鉴定 二 脱毒苗的检测 指示植物小叶嫁接鉴定法 首先从被鉴定的草莓采集长成不久的新叶 除去两边的小叶 中央的小叶带1 1 5cm的叶柄 把它削成楔形作接穗 而指示植物则除去中间的小叶 在叶柄的中央用刀切入1 1 5cm 再插入接穗 用线把接合部位包扎好 为了防止干燥 在接合部位涂上少量的凡士林 为保证成活 在2周内 可罩上塑料袋 置于半见光的场所 约经2周时间 撤去塑料袋 若带有病毒 嫁接后1 2个月 在新展开的叶 匍匐茎或老叶上会出现病症 电子显微镜鉴定法 直接观察草莓细胞器中有无病毒粒子的存在以及病毒颗粒的大小 性状和结构 从而确定草莓组培苗是否完全脱毒 二 草莓无病毒苗的繁殖和利用 1 防止蚜虫的危害由于草莓病毒主要是蚜虫传播的 所以要搞好防蚜虫工作 传播草莓病毒的主要有草莓茎蚜 桃蚜和棉蚜 防治时可使用马拉松乳剂 氧化乐果乳剂等接触杀虫剂 防治期5 6月 9 10月 特别是9 10月一次 可防止蚜虫的越冬 为保证种苗的无病毒 在原种种苗生产阶段 应在隔离网室中进行 采用0 4 0 5mm大小的规格 其中以300号防虫网为好 2 程序及提高繁殖率的措施 草莓无病毒苗的繁殖程序可分五步 包括 脱病毒鉴定生产出无毒苗 原种种苗培养 原种种苗繁殖 良种种苗繁殖 生产用苗繁殖和栽培苗繁殖 前四步在隔离室中进行 后一步在露地进行 为提高无病毒母株的繁殖株数可采用赤霉素处理和摘蕾的方法 赤霉素处理用5 10 6的浓度 在5月上旬和6月上旬分两次进行 摘蕾可减轻母株的营养负担 促进匍匐茎的大量发生 田间的每一株可繁殖150 200株 3 生产管理工作 注意匍匐茎排列位置 不要交措重叠 这不利采苗 采苗也要适时进行 无论秋季或春季种植 繁殖床必须要进行土壤消毒 防治草莓萎缩病 根腐病 萎凋病等的发生 为促使匍匐茎发生 要经常灌水 大蒜组织培养 大蒜是一种花粉败育的百合科葱属植物 生产用种主要靠无性繁殖 由于病毒侵染 传代等导致大蒜品种老化 退化严重 产量和商品性状降低 给生产造成很大损失 大蒜病毒主要有 大蒜花叶病毒 GMV 大蒜潜隐病毒 GLV 洋葱黄矮病毒 OYDV 和大蒜退绿条斑病毒 LYSV 大蒜组织培养 一 大蒜脱毒苗的培育 一 脱毒方法1 茎尖培养脱毒2 花序轴培养脱毒3 茎盘培养脱毒 二 病毒检测1 形态观察法2 指示植物法3 材料处理及培养二 大蒜单倍体育种 一 脱毒方法 目前脱除大蒜病毒的方法概括起来主要有茎尖培养 花序轴离体培养 茎盘圆顶培养 体细胞胚再生培养 1 茎尖培养脱毒 1 培养方法 处理 大蒜鳞茎先在4 下贮藏30d左右 打破休眠 蒜瓣表面消毒后 剥取0 2 0 9mm长的带一个或不带叶原基的茎尖 接种在附加一定激素的培养基上 培养基 MS B5 LS 蔗糖30g L 琼脂8g LpH5 8 6 0 培养条件 温度25 1 光照强度1200 2000lx 每天光照12h 培养结果 40d后 开始分化 形成侧芽 100d后形成丛生芽 2 影响茎尖培养脱毒的主要因素 a培养基 培养基中的无机盐成分 培养基的种类 激素的种类和配比等 b茎尖大小 c热处理或茎尖培养结合热处理 2 花序轴培养脱毒 处理晴天采摘蒜薹 用消毒后的工具剪取蒜薹总苞段 70 酒精表面消毒1min 再在0 1 氯化汞中灭菌12min 无菌水冲洗4 5次后 剥去外层苞叶 横切花序轴顶部 去除花茎部分 将花序轴接种于固体培养基上 初代培养基B5 NAA0 1 6 BA2 0 pH6 5 继代培养基MS 6 BA2 0 NAA0 1 GA30 05 蔗糖20g L pH6 2 3 茎盘培养脱毒 主要技术流程 将带有茎盘的鳞茎基部切成立方体小块 放在70 的酒精中消毒5min 去掉贮藏叶和营养叶 剩下约1cm厚的茎盘 每个茎盘分成4份 接种到LS固体培养基上 置于25 3000LX 光照16h d条件下培养 大约1周后茎盘外植体表面出现多个圆顶状结构 并长出愈伤组织 2周后分化出绿芽 3周后茎长至1cm左右 生长调节物质对茎盘分化具有抑制作用 二 病毒检测 目前普遍应用的植物病毒检测方法有 形态观察法 指示植物法 电子显微镜技术 血清学方法 多聚酶链式反应技术 一 形态观察法 大蒜病毒主要表现出花叶 扭曲 矮化 退绿条斑和叶片开裂等症状 但对症状不甚明显的大蒜潜隐病毒 不宜采用此方法 二 指示植物法 1 鉴定大蒜病毒的指示植物主要有 藜科 十字花科和百合科等植物 2 具体操作 取贮藏叶 或培养长出的叶 约1g 加入10倍的pH7 0的磷酸缓冲液在研钵中研碎 制成病毒汁液 再将500 600目的金刚砂撒在藜或蚕豆等指示植物的叶片上 蘸取病毒汁液进行摩擦接种 2周后观察结果 三 大蒜单倍体育种 利用花药培养技术获得大蒜的单倍体植株 结合各种理化方法诱发突变 并通过人工染色体加倍能够获得纯合二倍体或多倍体 从而筛选和保存优良的突变 1 取材和消毒 取材 春季大蒜抽薹是 选取田间生长健壮的带有1 2cm花茎的花苞 用1 醋酸洋红染色 观察花粉的发育时期 当花粉发育到单核期时采集花苞 消毒 先用流水冲洗干净后 再用70 酒精进行表面消毒1min 然后在超净工作台上用0 1 氯化汞消毒6 10min 无菌水冲洗3 5次 2 接种和培养 接种 用镊子和解剖针小心剥开花苞 将花药接种到N6基本培养基上 诱导愈伤组织的激素浓度为2 4 D3 6 BA2 愈伤组织继代的培养基为N6 2 4 D0 5 6 BA1 0培养 温度25 光照16h d 接种后25天后形成愈伤组织 第二节果树组织培养 苹果组织培养葡萄组织培养 苹果组织培养 一 苹果脱毒与快繁 一 苹果的脱毒 二 苹果病毒检测 三 苹果快繁二 苹果的花粉培养三 胚的培养 苹果易感染苹果褪绿叶斑病毒 苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒等 一 苹果的脱毒 目前采用的苹果脱毒措施主要有微体嫁接培养 茎尖培养 热处理及热处理结合茎尖组织培养等 1 微体嫁接培养 无菌条件下选用培养30 40d的砧木品种M7 M4 M26的无根苗 取1 5cm左右作为砧木 用解剖刀劈开 同时选长势好的苹果品种无根苗茎尖 切成楔形作为接穗 插到砧木切口中 使接穗和砧木形成层对齐并紧密接触 然后插入ASH生根培养基中进行培养 培养条件为 温度26 光照10 16h d 光照强度为3000Lx 长成完整植株后进行驯化移栽 优点 能快速获得大量无病毒苹果苗 并当年成定植苗 缩短育苗周期 用组织培养快速繁殖苹果无病毒砧木 比实生砧木能够保持种性 排除了实生砧木不稳定 易分离的弊病 2 热处理脱毒 处理时间和处理温度的最佳组合为 热处理时间35d 白天温度37 1 5 晚上温度32 1 5 这样既可脱去苹果退绿叶斑病毒 ACLSV 和苹果茎沟病毒 ASGV 又可提高成活率 3 热处理茎尖组培法脱毒 将休眠的植株置于温室内 在20 25 条件下诱导萌发 待长到5 6片叶时 置于脱毒室内 首先在32 和35 温度下 分别预处理1周 然后在38 0 3 相对湿度80 的条件下处理25 35d 得到生长健壮的5 10cm长的新生嫩枝 热处理 接种和培养 将热处理的新稍嫩枝切成1cm左右的茎段 首先用70 的酒精消毒30 60s 再用0 1 的氯化汞消毒10min 最后用含0 5 维生素C和0 3 柠檬酸的无菌溶液冲洗3次 将消毒后的茎尖在无菌条件下剥取生长点 切取2mm茎尖接种到含有6 BA和IBA的MS培养基上进行培养 培养条件 温度25 光照12 16h d 光照强度为1000 1500Lx 当试管苗长至2 3cm时 转移到生根培养基中诱导生根 根系发达后进行驯化移栽 二 苹果病毒检测 木本指示植物法 该法比较简单但需时间较长 2 3年 酶联免疫吸附法 ELISA 该法操作简便 快速的优点 RT PCR法 该法灵敏度高 特异性强 是果树病毒检测的理想方法 三 苹果快繁 1 茎尖分离2 初代培养3 继代增殖培养4 生根和驯化移栽 1 茎尖分离 早春叶芽即将萌动前 从健壮母株上 选取带芽或茎尖的茎段 先用流水冲洗2h 0 1 升汞液浸15min 在无菌条件下剥去外层鳞片和叶片 再次用0 1 升汞液消毒5min 最后用无菌水洗5次 进一步剥至茎尖 切取1 3mm的顶端分生组织接种在培养基上进行培养 2 初代培养 初代培养的培养基为MS 6 BA2mg L 茎尖接种到初代培养基开始膨大后 转入恒温箱中进行暗培养 培养温度26 28 一般在暗培养中增殖2 3代 随后要转入光照下 以使苗生长健壮 光强以1500 2000lx为宜 培养基中加入聚乙烯吡咯烷酮 谷氨酰胺 抗坏血酸或活性炭等 可有效降低褐变率 3 继代增殖培养 继代培养的培养基一般采用MS 6 BA0 5 1mg L NAA0 05mg L 有人还添加GA30 5mg L 继代培养光照强度为2000Lx 光照时间10h d 温度25 28 4 生根和驯化移栽 当试管苗长至2 3cm后转移到生根培养基中诱导生根 生根培养基为MS IBA0 5 1 0 3 蔗糖 0 5 琼脂 当分化出新根后在转入到1 2MS培养基中继续培养 使根进一步伸长 当根系发达后 打开瓶口炼苗3 5d 然后移栽驯化 苹果的试管苗也可以不进行生根 而直接嫁接到苹果矮化砧木上 既可保持树体有良好的矮化特性 又可通过采用无病毒繁殖材料妥善地解决无病毒繁殖问题 生根苗移出进行砂培2 3周 最后移到土壤中 其成活率可达26 7 56 9 二 苹果的花粉培养 1 选取小孢子处于单核期的花蕾 小孢子单核期的花芽外部形态特征是 花芽已充分开放 有4 5片叶完全展开 中心花蕾吐红 周围花蕾明显增大 但花序尚未分离 2 把花蕾插入水中 放在1 3 的冰箱上预处理 3 取花蕾在70 的酒精浸约0 5min 再在10 漂白粉上清夜中浸15 20min 无菌水冲洗3 5次 4 胚状体的诱导 从花蕾中取出花药 接种到MS 2 4 D0 4 KT0 2mg L IAA4mg L 3 8 蔗糖的固体培养基上培养 每瓶30 50个花药 在25 30 下培养70d后 由变褐的花药裂口处开始产生胚状体 5 无根苗的诱导 把产生胚状体的花药接种MS IBA0 5mg L GA30 1mg L BA1mg L 3 5 蔗糖的固体培养基上培养 在25 30 和光照10h下 约经40 100d以上 胚状体可形成次生胚状体或丛生芽 进而发育成无根苗 6 根系的诱导 切取无根苗 转接到1 2MS IAA1 5mg L 15 2 蔗糖的固体培养基上培养 约经15 20d 小苗茎基部长出根 形成完整植株 也可用50 100mg LIBA溶液浸泡苗梢基部15 30min 再插入无生长素的培养基上 也能较顺利地诱导生根 7 花粉植株的移栽 在春 秋季进行 保持15 20 和高空气湿度 一般可使成活率达到40 以上 8 对有些不易生根和提早开花的植株 可用嫁接法进行繁殖 三 胚的培养 1 幼胚培养一般在授粉后30 50d内取幼果 因这时种子内的胚已开始发育 较易培养成功 成熟胚培养取自处于成熟期果实的种子 胚培养的材料只需进行表面消毒 一般用70 酒精擦拭即可 2 切开果实 取出种子 剥出幼胚或成熟胚 接种在BA0 25 IAA0 5mg L的1 2MS培养基上 培养条件为25 30 和1500 2000lx光照14h 3 分化增殖时 把苗切段移植到加有BA0 5 1 0mg l和CH300的1 2MS培养基上 在光下培养 可使绿苗得到增殖和生长 4 苗的生根或嫁接和移栽方法 同茎尖培养 葡萄组织培养 一 葡萄快繁与脱毒二 子房的培养三 葡萄胚胎培养 一 离体快繁技术 1 茎尖培养 1 选材接种从田间生长旺盛的葡萄新梢顶端取1 2 的茎尖 除去幼叶后在5 次氯酸钠溶液中浸泡2 3min 消毒灭菌 以后用无菌水冲洗3次 再在0 1 升汞溶液中浸泡约2min 以后用无菌水冲洗4次 在无菌条件下分离出约1 2 长的茎尖 接种到分化培养基上 一 葡萄快繁与脱毒 2 植株再生芽诱导 茎尖在1 2MS 6 BA1 0 IAA0 2 KT1 0的培养基上膨大变绿并形成大量丛生芽 在B5 6 BA0 5 IAA0 5 KT0 5的培养基上 丛生芽伸长 茎尖的分化 接种成活的茎尖1个月左右开始分化幼叶和侧芽 2个月左右 由于侧芽的不断增生 形成芽丛 不同品种对BA和NAA的反应不同 故生长有明显区别 如巨峰顶端优势强 侧芽生长势弱 故增殖率低 但成苗率高 白羽和贵人香等侧芽分生能力强 可在幼茎上多次分枝 故成苗率低 2号大白粒等个别品种 则幼茎短缩膨大呈球形 很难成苗 茎尖苗的生长 在茎尖分化培养中产生的成苗率低和成苗困难 密集生长的芽丛 可将分化培养基中的BA浓度减低至0 5mg L 同时添加GA30 2mg L 则经1个月的培养 就可长成2 3 高的幼茎 此外黑暗处理对幼茎的伸成 提高成苗率 也有明显的效果 3 生根与移栽切取2 3cm的茎尖苗 接种到1 2MS IBA0 5 1 0mg L培养基中 进行生根培养 其中添加和琼脂0 4 1 2周后幼苗开始生根 1个月形成完整的根系 同时具备5 6片新叶 生根率一般在90 以上 移栽时洗去根上的培养基 栽到蛭石基质内 使根系具有良好的通气条件 种后盖上塑料薄膜 经7 10d锻炼适应后可去掉 移栽成活率在90 左右 提高葡萄试管苗移栽成活率要注意 a 幼苗生长要健壮 b 要保持空气湿度 c 根际通气良好 d 要尽量减少杂菌污染 e 浇灌的溶液浓度不能过高 2 茎段培养 1 取材与消毒取健康植株嫩梢的上部 去掉叶片 自来水冲洗2 3h 无菌条件下 用70 的酒精振荡浸洗20s后 用0 1 氯化汞加一滴吐温振荡消毒5 10min 无菌水冲洗4 5次 剪除两端接触药液部分 剪成1 2cm单芽茎段 接种到培养基上进行培养 温度26 2 光照强度2000Lx 光照时间12h d 2 外植体的启动培养外植体的启动培养基为 MS IAA0 05 0 2 6 BA0 0 5 3 生根培养生根基本培养基为1 2MS 附加一定浓度的IBA或NAA与KT的组合 当苗长到6 7cm 有3 5条根时 进行炼苗移栽 二 试管苗的驯化移栽 1 光培炼苗将培养瓶转入干净的温室 去掉瓶塞 在2 4万Lx的自然光下炼苗5 7d 当瓶口长出油亮的叶片 幼茎变淡红色时即可出瓶 2 沙培炼苗将经过光培的幼苗栽入沙床 覆上塑料薄膜 沙床温度维持在25 左右 湿度在12 左右 最初3d棚内温度保持在25 左右 相对湿度保持在80 95 光照7000 10000Lx 以后逐渐通风 10d后除去所覆薄膜 3 温室营养袋炼苗将沙培苗在空气湿度不低于70 温度20 25 无直射光下栽入肥土 沙 腐熟有机肥为1 1 0 2的营养钵中 最初几天对温 光 湿的管理与沙培相同 4 大田苗圃移栽选疏松肥沃 排灌水方便 距温室较近且日照良好的地块做苗圃 将营养袋苗移栽苗圃即可 三 葡萄无病毒苗的培育 葡萄受到26种病毒的危害 由于病毒的危害 葡萄的长势减弱 产量降低 果实的糖分含量减少 风味变劣 葡萄无病毒种苗的培育方法有 茎尖培养法 热处理法 热处理结合茎尖培养 现在已广泛用茎尖组织培养和热处理结合的方法来培育葡萄无病毒苗 1 热处理理脱毒 热处理有不同的方法 1 葡萄无性系处理材料置于38 CO21200 10 6的人工空气侯箱内 经30min处理 较易从枝条尖端或休眠芽中除去扇叶病毒 卷叶病毒则处理3个月或更长时间也难以除去 黄点病毒处理11个月也无效 2 直接将葡萄蔓浸泡在50 的温水中10 20min 可以治疗皮尔斯病 但不能治疗黄点病及卷叶病 2 茎尖培养脱毒技术 茎尖组织培养脱毒要经过7个时期 A茎尖接种后的变绿增长期 B形成畸形叶期 C形成许多芽和芽的伸长期 D许多芽展开小叶伸长期 E诱导发根期 F地上部和地下部的伸长期 G上盆期 1 茎尖接种后变绿 增大期的培养从被病毒感染的植株上取材 在5 下冷藏保存 以后在25 相对湿度80 16h的长日照条件下水培 再从长出新芽经消毒后切取茎尖进行培养 大小约0 2 0 3mm 带一个叶原基 以MS培养基作基本培养基本能添加GA3 否则培养的茎尖大部分黄化 生成膨软的组织 一转移就完全损失 实验结果以1 2MS 添加NAA0 1mg L BA1 0mg L Kt0 5mg L 腺嘌呤4 0mg L 蔗糖30g L 琼脂6 0 pH5 8为好 培养的茎尖成活率较低 仅13 3 2 从畸形叶和茎叶伸长期 处于变绿 增大起的茎尖如继续在上述培养基进行继代培养 不仅不生长 最后还会枯死 将原来培养基中的NAA0 1mg L 改换为IAA0 2mg L 采用1 2MS 添加IAA0 2mg L BA0 1mg L KT0 5mg L 腺嘌呤4 0mg L 蔗糖30g L的培养基 则有34 1 的茎尖可生长到达畸形叶期 3 小叶展开到到上部分和地下部的生长期 从D期到F期 为诱导生根 将2cm左右的芽切下 转入Galzy 1964 培养基 添加NAA0 1 经60d的生长 发根率可达到89 8以上 而地上部分也进行生长的只占10 2 为促进地上部也同时进行生长 在诱根培养20d 根长0 5cm左右时转入无激素的Galzy 1964 培养基 则有73 7 的植株地上和地下都可以同时生长 经1个月培养 地上都可达4 5cm 叶数可达5片左右 4 上盆 G 期从培养瓶中取出苗时要注意绝对不要伤根 家昂琼脂冲洗掉 以后种在以蛭石为基质 直径6cm的塑料钵中 栽培温度15 25 光照度为3000lx 光照时间为一天16h 相对湿度80 的锻炼室中进行 约培养20天 地上部开始伸长 发绿 则可移至通常的温室中进行隔离栽培 3 葡萄无病毒苗的鉴定和生产 葡萄脱毒苗的鉴定方法有 指示植物嫁接鉴定法 抗血清法 电镜检测法等 葡萄卷叶病毒尚无草本寄主 常用芽接指示植物 品种有Baco Mission和Ln 33 其中以Ln 33反应较灵敏 有的每株嫁接后当年秋天发病 而Mission需经4年才表现症状 Ln 33易繁殖 易嫁接 抗霜霉病 无自然感染的黄点病 嫁接后只表现温和症状 是现有的最好指示植物 葡萄黄点指示植物有Ln 33 Baco 22A Esparte是最好的指示植物 春天嫁接 第二年秋天即出现症状 二 子房的培养 1 分离培养 取开花前两天的花 经灭菌后 小心地去掉花冠和雄蕊 而不要伤害子房 用小刀将子房从基部切下 接种到Nitsch培养基上 培养室保温25 光照2500kx 每天照明12h 2 有机添加物的作用 有机添加物对培养子房的发育皆有促进作用 依其作用大小依次为麦芽提取液 鲜葡萄汁 黄瓜汁和葡萄蔓汁 二 子房的培养 3 生长调节物质的作用 葡萄子房培养在添加有植物生长调节物质的培养基中 可促进单性生长 并在培养15周后在有些处理中可以观察到浆果变色的情况 从培养子房的体积看 在基本培养基中添加有BA0 2的处理 要超过对照 无激素 子房体积最大的为添加BA0 2mg L NAA0 2mg L GA31mg L 三 葡萄胚胎培养 一 胚培养1 成熟胚培养取成熟的浆果 常规消毒后在无菌条件下取出种子接种于Nitsch附加一定量GA3和IAA的培养基中 待种子萌发长出真叶后转移到1 4MS IAA1 0的培养基上成苗 低温预处理和切喙处理能有效地促进种胚的萌发 2 幼胚培养分为直接培养和间接培养 直接培养即盛花后30d采集幼果 在5 1 低温下处理40d 消毒后在无菌条件下从果实中取出种子 剥出幼胚接种到培养基上培养 间接培养即选择无核葡萄中假单性结实的品种 在合子胚败育前 进行离体胚珠培养 阻止幼胚的败育 再剥取胚进一步培养成活 二 胚珠培养 使胚在珠被中进一步长大 然后取出 继代 发芽 形成植株 胚珠培育最佳接种期是花后40 55d Nitsch是适合胚发育的基本培养基 胚萌发和成苗培养用1 2MS培养基 在胚发育阶段一般加入GA3和IAA来打破胚的休眠 胚珠培养60 80d后 将幼胚取出移入添加6 BA1 0 NAA0 2的1 2MS培养基中萌发并直接成苗 也可添加6 BA0 5 NAA0 01的1 2MS培养基上长出大量不定芽 再分离单芽转到6 BA0 5 IBA0 2的1 2MS培养基上成苗 马铃薯组织培养 马铃薯原产于拉丁美洲 当被发现可以食用后 很快传到世界各地 成为栽培很广的一种作物 但是 当发现从外地引种栽培1 2个周期后 明显发现产量降低 植株变矮 并有卷叶的现象产生 经检测证明这是由于病毒引起的退化现象 马铃薯脱毒技术 危害马铃薯的病毒有17种之多 如X病毒 S病毒 Y病毒 M病毒 A病毒 奥古巴花叶病毒 纺锤形块茎病毒等 由于马铃薯是无性繁殖作物 病毒逐代积累 日益严重 引起严重退化 采用组织培养技术 通过一定良种繁殖体系 生产优质种薯 是保证马铃薯高产 稳产的一项有效措施 1 脱毒种薯生产程序 采用微茎尖组织培养的方法 诱导出苗 采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒 经鉴定后 无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗 试管基础苗在无菌条件下 采用固体 液体培养基相结合的方法 进行扩繁基础苗 在防虫网室栽植或封闭温室扦插 生产出原原种 或称脱毒小薯 用原原种在一定隔离条件下产生原种1代 以后逐级称为原种2代 良种1代 良种2代 2 茎尖培养脱毒 1 取材和培养室内发芽 芽经热处理 38 2周 然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖 在自来水下冲洗1h左右 无菌条件下先用95 的酒精浸润组织 在用5 的漂白粉溶液浸泡5 10min 然后用无菌水冲洗2 3次 分离茎尖时 把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离 逐层剥去幼叶 露出圆滑的生长点 可以留2个叶原基 随即接种于MS 液体 IAA0 1 GA30 1 pH5 8 或White NAA0 1 1 BA0 05 培养条件 21 25 3000lx 16h d 2 继代和生根 培养成功的马铃薯脱毒苗 经鉴定后 采用固体 液体培养基相结合方法括繁 取试管苗单节切段扦插在固体培养基上 每瓶可插20个左右茎段 经20d左右使可发育成5 10cm高小植株 可在进行切段繁殖 此法速度快 每月可繁殖5 8倍 试管苗多节接种在液体培养基上 进行浅层静止液体培养 3 移栽驯化 炼苗期温室内的温度 白天23 27 夜间不低于14 炼苗的具体方法是 移植前7d左右 将长有3 5片叶 高2 3cm的试管苗 在不开瓶口的状态下 从培养室移至温室排好 移植 将装好基质的营养钵紧密的排放于温室内 每1m2排放营养钵300个左右 排好后用喷壶浇透水 将经光 温锻炼好的试管苗从瓶内用镊子轻轻取出 放到15 的水中洗去培养基 放入盛水的容器中 随时取随时扦插 防止幼苗失水 大的幼苗可截为2段 每个营养钵插一个茎段 上部茎段和下部茎段分别扦插到不同的钵内 3 移栽驯化 移栽后管理 一般情况 扦插后最初几天 每天上午喷一次水 保持幼苗及基质湿润 但喷水量要少 避免因喷水过多造成地温偏低而影响幼苗生长和成活 切忌暴热时凉水浇苗 为提高水温 可提前用桶存水于温室中 随幼苗生长逐渐减少浇水次数 但每次用水量逐渐加大 此外为保持温室中有较高的湿度 以防幼苗茎皮硬化 影响切繁效果 在育苗不需要浇水的时候应将温室内所有空地全都浇上水 在幼苗生长及整个切繁期 温室内的相对湿度保持正在85 以上 气温白天控制杂25 28 夜间保持在15 以上 基础苗切繁前和培育大田定植苗 一般不在追肥 但基础苗开始切繁后 d要喷一次营养液 此后每隔10d一次 直至切繁终止 3 脱毒苗切繁 切繁方法 脱毒苗切繁主要是剪取顶部芽尖茎段 主茎芽尖和腋芽芽尖 直接扦插 正确的切繁原则 保证每次剪切后 基础苗仍能保持交好的株型和营养面积与较多的茎节 不仅生长正常 而且又能萌发出多个腋芽供下次剪切 具体方法 扦插后15天左右 当基础苗长有 个展出叶 苗高3 5 厘米时进行首次切繁 从基础苗茎基部上数 个茎芽上方 用锋利刀片将上部茎芽切下 茎段不小于 厘米 扦插到浇透水的营养钵内 培育供大田定植的脱毒苗 也可以作为供切繁的基础苗 第一次剪切后10天左右 基础苗上萌发的腋芽长大时进行第二次切繁 同第一次一样 将剪切腋芽基部的第一个叶片留下继续萌发腋芽 将上部茎尖芽段剪下扦插 如基础苗上除剪取的腋芽外 仍有多个未萌发或未长大的腋芽时 可将牙牙全部切下 如果是高位腋芽 要连同着生腋芽的茎段一起剪下 以便基础苗始终保持较好 有利于继续切繁的株型 延长切繁期 以后无论切繁多少次 其方法和原则相同 在生产需要时间允许 所有切繁培育成的脱毒苗均可作为基础苗进行切繁 四 马铃薯无病毒苗的鉴定材料 1 指示植物鉴定 在马铃薯的病毒鉴定中 汁液鉴定中是最常用的方法 病毒 病毒和纺锤块状病毒很容易通过汁液来接种 2 鉴定寄生的准备 马铃薯常用的鉴定寄生植物有笕科的千日红 茄科的洋酸浆 毛曼佗罗等 寄生植物应在无虫网室中培养 温度控制在15 25 提供充足的肥 水 光等条件 保证幼苗健壮生长 系统发病来鉴定寄生 一般用 片真叶的幼苗 局部发病的寄主利用充分展开的真叶 每个病毒样品可接种 株 并做好标记 接种液制备及接种 接种液制备 一般以表现病状明显的叶作为接种材料 叶片洗净后 在消毒的研钵中研成糊状 用纱布滤出汁液 在意蒸馏水稀释10倍作为接种物 以防过浓的汁液对鉴定寄生产生伤害作用 接种 在鉴定寄生植物的叶面 均匀的喷布600目的金刚砂 也可将金刚砂少许混入接种物中 然后用左手心紧靠在寄主的背面 以右手实指蘸取接种液 均匀的在叶背面擦过 以不造成叶片产生伤痕为度 最后把叶面上多余的接种物用清水冲洗干净 放置在15 24 的防虫室中 一般5 10天可发病 五 马铃薯无病毒株的繁殖和保存 1 无病毒株的繁殖 直接块茎繁殖这是常用的方法 把少量无病毒小苗直接移入无虫网室的土壤中 利用产生的块茎继续繁殖 并进行严格的病毒鉴定 一旦发现病毒再侵染 即行淘汰 将经过 次繁殖的无病毒块作为一级原种 提供大田繁育体系作进一步扩大繁殖 扦插繁殖把无病毒植株栽于无虫室的营养钵中 个月以后切顶芽做插枝 切去顶芽后 又处进侧芽发生 很快长成侧枝 扦插时 将扦插最下面的叶除去 插入经过消毒的砂壤中 插入深度为两个节间 在插后 周时间内 维持土壤湿润 插枝就能产生新根 有些插枝地下部分会结出块茎 应及时除去 否则这些插枝不能生根 最后会枯死 经过2周多的生长时间 插枝就可以移栽 或进一步作为切取插枝的母株 或让其块茎提供一级原种 母株应经常更新 防止因太老导致生根很困难 2 无病毒株的保存 长期保存马铃薯无病毒试管植株的方法有两种 继代培养 对保存的无毒苗不断地继代培养 每个品种可以接种2 10瓶 为便于保存可选用较大的150ml三角瓶 内加入一半以上体积的培养基 琼脂含量要高于一般培养基 可用不含激素的基本培养基 以延缓小苗生长 每瓶接种2 3个切段 培养温度可在5 25 在较低温度下 保存的时间更长 每隔2 3个月继代培养一次 达到保存的目的 低温保存 当试管的植株长至2cm左右进 放入温度为4 的冰箱中 并放在暗处保存 可达1年左右 第四节花卉植物的脱毒与快繁 菊花百合菊花的组织培养快速繁殖花器的组织培养菊花花瓣的培养鳞片组织培养菊花无病毒苗的培养打破休眠的方法 菊花 一 菊花的组织培养快速繁殖1 外植体的选取 灭菌和接种2 培养基及培养条件3 继代培养4 生根和移栽 1 外植体的选取 灭菌和接种 选取无病虫害 粗壮的茎尖和茎段 要求叶密茎粗 如以花序轴为材料 应选取具该品种典型特征的 饱满充实的蕾 最好要开放而未开放的花蕾 采后便于表面灭菌 过于幼嫩的花蕾 不易灭菌和剥离 茎尖嫩叶不要去掉太多 以免伤口面过多 造成灭菌时过多伤害 过多的叶可在灭菌后 接种之前除去 茎段除去叶 留一段叶柄 无菌水洗后 将茎段面及叶柄再切去一小段 以减少灭菌药物的毒害 接种时按材料生长极性的上下端 正放培养基上 尤其是茎尖不可倒置或侧植 2 培养基及培养条件 培养基 MS B5 N6 White等 但大多采用MS培养基 添加BA2 3mg L NAA0 02 0 2mg L 菊花对激素的要求并不是很严格的 适用的范围很广 温度 22 28 都可以 以24 26 最好 光照 12 16h d为宜 光强1000 4000Lx较好 3 继代培养 外植体经培养后 一般经4 6周 最初分化率及分化数量都较少 但随继代次数增加 增殖方式除诱导丛生芽增殖外 也可用茎切段作微型扦插繁殖 丛芽增殖时 将芽丛切成小块 转到分化培养基中即可 微型扦插则以嫩茎梢作材料 将嫩梢剪成1节带1叶的茎段 然后将切段基部插入MS或MS NAA0 1 1mg L的培养基中培养 4 5周后 腋芽即生长成小植株 再照上述方法切剪茎段 重复培养 4 生根和移栽 菊花无根苗生根一般较容易 通常在增殖培养上久不转瓶 即可生根 但这种根的根毛较少或无 不利将来移栽和生长 所以常用下列方法处理 一是无根苗的试管生根 切取3cm左右无根嫩茎 转插到1 2MS NAA 或IBA 0 1mg L的培养基中 经两周即可生根 然后移栽驯化 二是无根嫩茎直接插植到基质中生根 剪取2 3cm无根苗 插植到珍珠岩或蛭石的基质中 基质事先用生根激素溶液浸透 l0d后生根率可达95 100 4 生根和移栽 移栽初期保持高湿度条件 营养钵基质浇透水 取出生根的试管苗 洗掉附着在根部的培养基 用竹签在基质上打一小孔 将幼苗插入基质中 然后加设小拱棚以保湿 随着幼苗的生长 逐渐降低空气湿度和基质含水量 转为正常苗的管理阶段 二 菊花花瓣的培养 1 外植体的选取 灭菌和接种在菊花开花前2 3d将已露白的花蕾 整个剪下 在自来水下冲洗十几分钟 然后在无菌条件下 用75 的酒精浸泡10 15min进行表面灭菌 后用无菌水冲洗两次 再用10 的漂白粉澄清液浸泡20m