第五讲 现代生物技术.ppt.Convertor.doc

第五讲现代生物技术第一部分、基因工程遗传信息的奥秘DNA由4种核苷酸组成(ATCG)每3个核苷酸编码一个氨基酸基因就是DNA分子上含特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。（一） 基因工程的概念 克隆（Clone）：是无性繁殖的译音 基因工程：是指在体外将外源DNA分子经切割和连接，插入至病毒、质粒或其他载体分子中，形成重组DNA分子，导入到受体细胞中，使外源基因在受体细胞中表达的过程。 常用的宿主如大肠杆菌、酵母、动物(包括昆虫)和植物细胞。 将目的基因转入微生物则成为工程菌；将目的基因转化于植物或动物则成为转基因动植物。理论上的三大发现 证明遗传物质是DNA DNA分子双螺旋结构及半保留复制 中心法则及遗传密码的破译技术上的三大发明 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 基因工程的载体 逆转录酶的发现基因工程操作的工具酶根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为三大类：1.限制性核酸内切酶（内切酶）：将DNA分子在特定部位切开。2.DNA连接酶：将切割位点相同的两条链连接起来。3.DNA聚合酶：以母链DNA为模板，在引物的指导下，按母链核苷 酸序列，将游离的核苷酸结合到相应的位置而形成互补的双链DNA。限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的构建基因工程的载体 基因工程的载体必须具备以下基本要求： 1.在寄主细胞中能够独立复制； 2.易从寄主细胞中分离纯化； 3.有一段不影响自身扩增的非必需区域，使得插在其中的外源基因可以正常复制和扩增。基因工程的载体主要有六类： 1. 质粒载体：能自主复制；具有若干限制性内切酶的单一识别位点；有选择标记；较小的分子量和较高的拷贝数。 2. 噬菌体载 3. 柯斯质粒载体 4. YAC载体 5. BAC载体 6. 病毒载体：SV40通过感染方式将DNA送入哺乳动物细胞中。（二）基因工程的基本内容（重组DNA技术）重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆（molecular cloning）基因工程的主要步骤： 1.载体和目的基因的分离 2.载体和目的基因的体外重组 3.重组DNA转化受体 4.重组DNA的筛选和鉴定 5.克隆基因的表达(1) 基因组水平的鉴定(2) 转录水平的鉴定常用的方法Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交）RT-PCR 检测mRNAcDNAPCR（3）翻译水平的鉴定为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。主要方法：Western杂交 免疫检测（4）个体水平的鉴定 1.根据重组体的表型进行筛选 2.根据标志互补进行筛选 转基因成功的条件：（1）外源基因的单拷贝插入和被插入受体基因组的被扰乱的“综合效应”；（2）转化后的受体能够长成可遗传的生物个体。（三）基因导入的方法 植物材料：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、电激法等 动物材料：脂质体转化法、显微注射、逆转录病毒、精子载体、电穿孔、磷酸钙介导法等。 细菌材料：电激转化或转导 （四）基因工程的应用1、基因工程药物基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质-肽类药物。基因工程药物（Genetic engineering drugs）：系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。基因工程药物的种类 基因工程DNA重组药物主要成分为多肽或蛋白质类，大致可分为以下三大类： 1. 激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子（human somatotin )，人胰岛素（human insulin)，人生长激素（human growth hormone） 2. 细胞因子类药物：人干扰素（human interferons），人白细胞介素（human interleukina)，集落刺激因子（colony-stimulating factors，CSF)，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO） 3. 酶类及凝血因子类药物：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。 重组原核微生物生产商品： 结构独特、活性高、副作用小、成本低等优点真核细胞表达重组蛋白：正确的加工（形成正确二硫键、切割前体）、特异的翻译后修饰（蛋白质糖基化、对氨基酸的修饰）等优点基因工程药物中可能杂质与污染物基因工程药物中可能的杂质有残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、蛋白质突变体和蛋白质裂解物等。主要污染物有微生物、热原和病毒等。主要检查项目有外源性DNA、宿主细胞蛋白质、其它有关杂质和细菌内毒素检查。目前世界上利用基因工程主要生产药物与疫苗，产值较高的有：胰岛素，生长激素，干扰素，乙肝疫苗等基因工程药物具有低成本，高回报的特点基因工程重组胰岛素 干扰素生物药物（biopharmaceutics或biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学等学科的原理与方法制得的天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。生物药物主要包括生化药物（biochemical drugs）、生物技术药物（bio-technology drugs)和生物制品（biological products)等。生化药物是从动物、植物及微生物等生物体分离纯化制得的生化基本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、多糖、脂质、核苷酸类等。生物技术药物是利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系，用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物（或生物工程药物）。生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。2、植物基因工程转基因农作物的发展耐农药/抗虫能力：第一代转基因农作物 Bt抗虫玉米 传统玉米改变营养组成：第二代转基因农作物“黃金米”可以防治维生素A缺乏症生产医药与工业上应用：第三代转基因农作物植物转基因产业化的技术瓶颈问题1基因资源的问题：I： 功能基因和对应的调控元件匮乏；II： 植物源和非植物源基因的区别；III：单基因与QTLs、cDNA与基因组序列的区别；IV：植物对环境的应答-转录调控过程并非“开”和 “关”那么简单。从环境刺激到植物作出反应实际上是一系列复杂的信号传递过程，通过转基因技术给植物转入一个单基因，并不一定能对逆境基因的表达有很大影响，显著的提高逆境基因的表达可能需要对整个信号传递通路进行调控才能实现。2. 基因转移技术的问题呼唤新的转基因技术不依赖植物组织培养再生过程的转基因技术叶绿体转基因技术：技术过程：技术关键：3. 转基因植物产业化技术集成和标准化 3、动物基因工程转基因鼠的应用：动物模型、基因敲除、细胞功能、表达系统转基因动物：猪、奶牛、羊等 动物乳腺生物反应器生产药物克隆动物4、基因工程菌在环境工程、食品生产中应用第二部分 细胞工程细胞工程(cell engineering)是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。 细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖 目的：获得新性状、新个体、新物质细胞工程的研究范畴动物细胞与组织培养植物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体工程胚胎工程干细胞与组织工程转基因生物与生物反应器细胞工程的发展一、植物细胞工程（一）植物组织培养技术植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体，培养在人工控制的环境里使其再生形成完整的植株。植物组织培养过程要经过一个从分化状态到脱分化的愈伤组织（或悬浮细胞）中间形式，然后进入再分化和再生过程。意义加快繁殖系数低或种子繁殖困难的植物；快速而经济地繁殖苗木；经济安全地保存植物种质资源。 优点可人为控制培养条件生长周期短、繁殖速度快管理方便，便于自动化培养材料经济培育无毒苗 造林树种和经济林木：杨树、桉树、泡桐、棕榈生产脱毒苗木：对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传越趋严重。对于植物病毒没有特效药，防止方法：（1）在田间早期拔掉病株，防止蔓延；（2）用杀虫剂消灭传播病毒的昆虫；（3）大多数植物病毒不侵入种子，可以用种子繁殖作物。植物茎尖培养脱除病毒原理（1）茎顶组织细胞的分裂速度比病毒移动速度快；（2）是茎顶组织内部还没有形成维管束或者维管束还未发达，病毒无法移动到茎顶部；（3）培养基中高浓度激素抑制病毒增殖。人工种子是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。 人工种子技术有着诱人的前景它同微繁殖技术一样，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素，且具有省地省工可直接在田间播种等优点。人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，这是微繁殖难以达到的。用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率。一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。人工种子应用于：（1）不稳定的基因型；（2）自交不亲合植物；（3）稀有珍贵物种；（4）人工授粉得到的杂种。 人工种子由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个部分组成。体细胞胚是制作人工种子的起始材料。一般要求是：发育阶段一致，呈游离状态，能大量得到，发芽率高。胚状体或芽诱导材料有：一般植物器官，愈伤组织，胚轴，原生质体等。产生体细胞胚是植物界的普遍现象， 人工胚乳是包埋体细胞胚的胶状介质。缺点：营养物质易泄漏，保水性差，而且胶球很易粘连等。 在胶球外包一层薄膜人工种皮。既能透水透气又能防菌的人工种皮。人工种子距离实际应用还有很大距离主要有三大难题有待克服：许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀。人工种子的贮藏有待进一步完善。（二）植物体细胞杂交原生质体融合（三）植物细胞大规模培养植物次生代谢产物的生产。利用植物作为生物反应器，生产生物碱、抗菌剂、类固醇等物质。单细胞藻类的大规模培养成为植物细胞工程的重要组成部分微藻的优点：全身具营养价值、高蛋白含量、高产、节能、生产周期短、开发海洋资源、操作过程简易二、动物细胞工程内容包括：人工受精、胚胎移植、体外受精、哺乳动物孤雌生殖、双胞及嵌合体、性别选择、细胞融合、染色体及染色体组改造及转移、基因及细胞器的转移、单克隆抗体、动物细胞大规模培养、动物细胞反应动力学及动物细胞反应器等。（一） 动物细胞培养技术生物技术：生产各种生物技术产品如：狂犬病、小儿麻痹症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。科学研究：病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。临床医学：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾病的治疗等。动物细胞生长特性 细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素，细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差，需氧少，不耐受强力通风与搅拌群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）培养过程产品分布细胞内外，成本高原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡 动物细胞的培养条件：温度：取材机体的正常温度人和哺乳动物 细胞培养的最适温度为3537。 二氧化碳：氧饱和值在60%以下pH 值在7.1-7.4之间无菌条件双蒸水3、动物细胞培养基液体，有维持液和生长液之分。其化学成分有：氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素及缓冲系统。维持液含低浓度或不含小牛血清，生长液含5% 20%小牛血清。动物细胞培养方法动物细胞可以自然合成或在外源基因指导下合成许多很有潜力的治疗药物。有的细胞本身就是产品，用于皮肤或骨髓移植、基因治疗等，某些有用大分子可以从培养的细胞体中提取。培养的细胞还可用于抗癌药物的筛选和毒性测定。（二） 动物细胞融合与单克隆抗体技术1、动物细胞融合技术在外力作用下，两个或两个以上异源动物细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。细胞融合的常用方法仙台病毒法 1两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 2通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 3两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 4进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。聚乙二醇（PEG）法 优点是易得，用法简单，成本低，融合效果稳定。 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生最多杂交细胞。 PEG溶液在 pH6.0 时细胞融合率最高。聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在质膜之间形成分子桥，其结果使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。 电融合法80年代出现。在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。电融合的基本过程：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 杂种细胞的筛选根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型： 异核细胞：非同源细胞的融合体。 同核细胞：两个相同细胞的融合体。 多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。杂种细胞筛选原理：将融合后的混合物置于选择性培养基上，终止同型多核、异型多核及未融合亲本细胞的繁殖过程。2、 细胞杂交瘤技术与单克隆抗体抗原决定簇：抗体可以高度特异的识别免疫抗原的特定区域。多克隆抗体：由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，而每个免疫淋巴细胞只可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。 单克隆抗体具有专一性强、质地均一、反应灵敏等特点， 要想获得大量的单一抗体，就必须从一个B淋巴细胞出发，使之大量繁殖成无性系细胞群体。由这种克隆制备到的单一抗体称为单克隆抗体。科学家根据癌细胞可以在体外培养条件下无限传代增殖这一特性，在PEG的作用下，将它与B淋巴细胞进行融合，结果得到了具有双亲遗传特性的杂交细胞。它既能在体外迅速增殖，又能合成分泌特异性抗体，从而成功地解决了从一个淋巴细胞制备大量单克隆抗体的技术难题。这项技术就是淋巴细胞杂交瘤技术。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology ）。瘤技术的基本原理单克隆抗体的应用诊断治疗病毒性疾病 -可以检测出多种病毒株间非常细微的差异，鉴定细菌的种型和亚种。诊断异常准确，误诊率大大降低。 “生物导弹”-单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。能精确地检测排卵期-新一代免疫避孕药，用精子，卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，人体就会产生对精子的免疫反应，从而起到避孕作用。人源单克隆抗体主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。（三）动物细胞大规模培养技术依据对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为：贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。动物细胞大规模培养方法贴壁培养悬浮培养固定化培养（四）动物细胞生物反应器随着生物反应器在生物制药中的广泛应用，反应器细胞培养技术也更为成熟，包括流加培养技术、灌注培养技术、细胞代谢分析技术、细胞密度在线检测技术、低血清细胞培养技术及无血清细胞培养基的应用等。（五）动物克隆3、动物克隆的技术路线核体与完整细胞融合细胞核移植细胞核连同其外表面薄层细胞质构成的颗粒称为核体。细胞核移植实验工作包括去核卵的制备、供体细胞的分离及细胞核移植等三个步骤。4、动物克隆技术的应用前景5、克隆动物产生的意义（1）从理论上证明了已分化的动物细胞是具有全能性的，在适当条件下，通过基因组的重新组织就可能发育成新个体。（2）从实际应用角度讲，克隆动物技术的成熟对动物资源的种质保存，尽可能多的保存地球生物圈内的生物多样性具有重要意义。（3）克隆动物对培育优良物种也有重要意义。（4）克隆动物还可以生产移植器官、培育优良畜禽品种，利用动物作为生物反应器生产药物和提供实验动物等几方面造福人类。 （六）干细胞工程一、干细胞的种类与特性 具有无限的或可被延长的自我更新和分化能力并可分化产生至少一种特化的细胞称为干细胞。 具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。按照干细胞的组织来源，它们可分为胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、神经干细胞等多种类别。除了胚胎干细胞外，造血干细胞、表皮干细胞、神经干细胞等又称为成体干细胞。胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞是最主要的三种（1）胚胎干细胞（EC）来源于胚胎发育早期的内层细胞团，它具有全能性，可以自我更新并分化成为体内各种组织。胚胎干细胞又是全能干细胞，分化能力强，可以无限增殖并分化成200多种细胞类型，从而形成机体的任何组织或器官，包括形成新的生殖细胞。动物胚胎干细胞可通过选择性流产、体外受精、将体细胞核移植到卵质内再植入代孕动物子宫等方法获取。（2）造血干细胞由胚胎干细胞发育产生，是所有血细胞的起源细胞。造血干细胞具有自我更新能力，主要存在于骨髓、外周血和脐带血中。造血干细胞能够产生红细胞、白细胞和血小板，如果没有造血干细胞，我们就无法存活。成年人体造血干细胞的80以上贮存在骨髓中，早期的造血干细胞移植又叫做骨髓移植。（3）神经干细胞主要存在于胎儿的脑组织包括大脑皮质、纹状体和小脑中，取材难度大、。在体外诱导和移植实验中，神经干细胞也表现出令人惊叹的分化潜力。神经干细胞功能的损伤会引起严重的中枢神经系统疾病。哺乳动物的许多已分化组织和器官中都保留了一些能够分裂形成该组织或器官的未分化原始细胞，这些细胞称为干细胞。 体内干细胞的意义在于源源不断地补充体内一些短命组织的细胞来源，如血液细胞、皮肤细胞以及精巢等，或者组织或器官受到局部损伤时，它们可以再分裂形成新的该组织和器官，是体内的一种自我修复机制。 脐血干细胞脐带血中含有丰富的造血干细胞。临床移植情况证明脐带血移植与骨髓和外周血造血干细胞移植相比，具有来源丰富、实物保存、对HLA配型要求低、配型成功率高、术后风险小以及移植费用低等特点。随着干细胞的研究和发展日益广泛深入，作为干细胞重要来源之一的脐带血也将越来越受到重视和青睐，被用于临床治疗的比例将越来越大。 人类胚胎干细胞的研究涉及胚胎克隆和种种敏感的伦理、道德、法律问题。组织工程是体外重建人体组织的技术，其研究内涵是应用生命科学和工程学的原理来恢复、保持和改善组织功能。体外重建人体组织的培养方式 可生物降解聚合物骨架培养：皮肤、神经、软骨、肝脏 微囊化培养：胰岛细胞的微囊化治疗糖尿病 中空纤维反应器培养：肝脏 微载体培养：造血组织 单层式、平板式反应器培养：肝细胞、造血组织（七）试管婴儿技术试管婴儿就是把精子和卵子从人体中取出来，放到特制的佩特里氏培养皿中让精子和卵细胞发生受精作用，受精卵经过培养后，再将其植入母体子宫，使其在体内发育成胎儿。由于受精作用发生在玻璃器皿中，就如同科学家用试管做实验一样，所以人们就把这样得到的婴儿形象地称为试管婴儿。体外受精的关键是：精子获得、卵子成熟度。第三部分 蛋白质与酶工程 (一) 蛋白质工程的产生、发展及意义 蛋白质工程的长远目标是创造人类所需要的各种性能优越的人造蛋白质。但目前主要是通过基因突变手段以制取天然蛋白质的各种人工突变产物。 一、蛋白质工程蛋白质工程的四个基础学科：蛋白质化学：蛋白质的氨基酸排列顺序测定，高分辨的分子结构解析，特别是蛋白质结构与功能的特殊联系方面的成就, 为改造蛋白质奠定了关键基础。分子遗传学：蛋白质工程需要对改造的蛋白质克隆基因,然后对该基因进行基因定位修饰,再设法将改造后的基因进行高效表达，这些工作正好是分子遗传学研究的主要内容。蛋白质晶体学：蛋白质结构获得高分辨率的解析，使人们获得大量的有关蛋白质结构的基本参数,诸如肽键的键长、键角，二硫键的可能取向等，为分子定向改造提供了可靠依据。蛋白质动力学：高级结构如何折叠而成？发挥活性？(二) 蛋白质工程的主要研究内容1. 蛋白质结构分析 收集大量的蛋白质分子结构（一级及高级）信息，建立蛋白质结构与功能之间关系的数据库，揭示形成这些结构（主要是立体结构）的机理和一般规律。2. 蛋白质结构与功能的关系 对肽链进行空间结构和生物功能预测；或根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过实验直接考察、计算，建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。这方面的工作尚在起步阶段。3. 蛋白质的改造 利用物理、化学及基因重组等方法对蛋白质进行改造。（三）蛋白质工程的主要研究方法1. 蛋白质组成及氨基酸测定方法Edman降解法 从N-末端开始测定氨基酸序列，其基本原理是： A: 偶联:在pH89条件下，多肽链N-末端氨基酸的氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）试剂偶联，生成苯异硫甲氨酰基多肽（PTC-肽）； B:裂解:在无水、强酸条件下，与PTC相联的氨基酸环化、肽键断裂，形成苯氨基噻唑啉酮氨基酸（ATZ-氨基酸）和一个减少了1个氨基酸的新肽链，此新肽链仍具有N-末端游离氨基； C:转化: ATZ-氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液中可转化成稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），再用薄层层析，气相层析，HPLC及质谱等方法进行分析。2. 蛋白质结晶和晶体生长技术3. 蛋白质立体结构测定方法（1）X-ray晶体衍射 X-ray： X-ray射入样品，非晶体沿X-ray传播方向形成一个斑点；晶体除在投射束形成中心斑点外，周围还有有规律分布的其他斑点。 X-ray遇到晶体后所产生的上述现象称为X-ray的衍射。可研究晶体结构中各类问题。 （2）核磁共振 是目前唯一能够用来测定蛋白质溶液三维结构的方法。（四）蛋白质工程的应用 1. 提高蛋白质的稳定性 2. 生物导弹 3. 嵌合抗体和人源化抗体（五）蛋白质工程的成果与问题基础研究方面: 酪氨酰tRNA合成酶是应用蛋白质工程技术研究得比较深入的酶之一。关于分子导向多肽药物的设计与研制: 生物杀虫剂的更新: 蛋白质工程存在的问题 目前单克隆抗体(简称单抗)用于临床疾病治疗问题之一是由于其绝大多数来源于小鼠(小鼠免疫球蛋白)产生有害的过敏反应。对于人体而言它是一种异体蛋白, 会引起人体产生人抗鼠抗体。若再度使用小鼠单抗,HAMA便与小鼠单抗结合,不仅会中和单抗使之失效,还产生有害的过敏反应。对此人们应用DNA重组技术对抗体进行改造，出现了抗体工程。包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗原结合区、单功能域抗体及全套抗体的研究,其主要目的是使鼠源性抗体“人源化”。存在的问题 1.构象的快速测定手段: 2.基因高效表达以及有效的下游技术代谢工程是指从操纵控制代谢的酶基因入手，试图控制和改变生物(首先是微生物)的代谢途径, 使其按照人类的意愿以提高某些代谢物的产量或/和获得新产品。与蛋白质工程只能改变蛋白质产物不同，从理论上说代谢工程能够对一切产物进行改造。 2、 酶工程 生物技术的四大支柱酶工程的应用范围（1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。酶工程主要采用两种方法：化学酶工程：天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究与应用。生物酶工程：主要通过以下三个方面来实现：(1)用DNA重组技术大量地表达、生产目的酶；(2)对酶基因进行修饰；(3)设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。酶工程的应用洗毛工艺中蛋白酶的应用控制蛋白酶治疗疾病脂肪酶 医药生产用酶青霉素酰化酶固定化酶固定化技术及应用固定化酶的特点：优点：1不溶于水，易于与产物分离；2可反复使用3可连续化生产；4稳定性好。缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活固定化技术1微型胶囊法2吸附3通过双功能试剂进行共价交联4胶格包埋5和水不溶性载体共价结合第四部分 发酵工程发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。又称为微生物工程。 发酵工程传统与现代生物技术发酵工程的发展简史1. 自然发酵阶段。历史悠久，早在几千年前，人们就开始从事酿酒、制酱、制奶酪等生产。2. 纯培养技术的建立。3. 深层通风培养技术的建立。4. 代谢控制发酵技术的建立。5. 固定化酶技术、细胞工程技术、基因工程技术的建立。现代发酵工程用经过DNA重组技术改造过的微生物来生产商业产品。利用生物反应器对发酵过程进行优化，实现大规模发酵。如生产胰岛素、干扰素、抗生素、色素等。发酵产品的下游处理：细胞的收获及破碎、杂质的去除、产物的初步分离、进一步纯化、最终的分离纯化。一、生产常用菌种的分离、选育和保藏在发酵工程中，优良高产菌种的分离选育最为关键，不仅为发酵提供了物质基础，还可以通过改善其自身生物学特性，提供各种类型的性状优良的突变株，提高产品质量，降低经济成本。（一） 菌种的分离（一）菌种的来源 1. 从自然界分离筛选。 它们体内目的产物量一般都很低，需要对其进行进一步的分离纯化，甚至采用诱变育种的方法，使其目的产物大量积累，符合工业生产的要求。 2. 直接索取或购买。（二）菌种的分离 1. 菌种的采集2. 菌种的分离筛选3. 菌种增殖（选择性培养基）4. 生产性能测定（形态、培养特征、生理生化特性、发酵周期、产量、耐受温度、最适温度、最适pH值、提取工艺等）5. 毒性试验（需要通过两年以上的毒性试验）（二）菌种的选育是运用遗传学原理和技术对某个用于特定目的的菌株进行多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状得以强化，去除不良性质或增加新的性状。主要方法包括： （一）诱变育种（二）基因工程育种（三）杂交育种（四）原生质体育种（三）微生物菌种的保藏与复苏（一）微生物菌种保藏 1、冷冻干燥或真空干燥保藏；2、超低温或在液氮中冷冻保藏； 3、转接培养或斜面传代保藏；4、土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。（二）复苏二、 发酵工艺条件的确定（一）培养基的选择和确定1. 培养基的营养成分包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。碳源:碳酸气；淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等；石油、正构石蜡，天然气，醋酸、甲醇、乙醇等。氮源:有机氮（豆饼或蚕蛹水解液，味精废液，玉米浆，酒糟水）；无机氮（尿素，硫酸铵，氨水，硝酸盐）；气态氮。无机盐:磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等，及铁、锰等微量元素。特殊生长因子: 硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等。2. 发酵生产中的常用的培养基类型 （1）斜面培养基（2）种子培养基（3）发酵培养基3. 培养基确定方法发酵培养基的选择必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求，原料价格应该低廉，质量稳定可靠。尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。并尽可能减少产生“三废”的物质。(二）发酵工艺条件的确定影响发酵的因素很多，如温度、pH、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行（三）发酵产物的分离提取、意义 菌体离心沉淀或板框压滤法使菌体与醪液分开;用喷雾干燥法直接做成粉剂; 酒精发酵醪蒸馏塔蒸馏; 抗菌素及有机酸根据产物的不同特性，采用离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取精制。 获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。 三、 微生物发酵过程根据微生物的种类不同（好氧、厌氧、兼性厌氧），分为好氧性发酵、厌氧性发酵和兼性发酵三大类：（1）好氧性发酵（2）厌氧性发酵（3）兼性发酵发酵的一般过程1、 菌种制备2、种子扩大培养3、发酵，是微生物合成大量产物的过程4、下游处理发酵结束后，要对发酵液和生物细胞进行分离和提纯精制，将发酵产物制成合乎要求的产品。四、 发酵操作方式及工艺控制发酵的操作方式：（1）分批发酵，营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出。（2）连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持稳定，微生物在稳定状态下生长。其反应器有搅拌罐式反应器和管式反应器两种。（3）补料分批发酵，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。连续发酵与分批发酵的比较优点：.微生物的生长和产物形成保持稳定；2.能实现机械化和自动化；3.提高设备利用率，缩短发酵周期；缺点：1.容易造成杂菌污染；2.对设备、仪器及控制元件的技术要求较高；发酵工艺控制对发酵影响较大的参数有：（1）温度，影响酶活性，改变菌体代谢方向。（2）pH值，影响酶或性，影响细胞膜的通透性。（3）溶解氧浓度。五、发酵设备进行微生物深层培养的设备统称发酵罐。 1、机械搅拌式发酵罐包括：通用式发酵罐和自吸式发酵罐。2、通风搅拌式发酵罐包括空气代生式发酵罐和高位塔式发酵罐。3、厌氧发酵设备六、 发酵工程的应用与展望1.医药工业2.食品工业 3.能源工业 4.化学工业 5.农牧业 6.冶金工业和环境保护。第五部分 分子检测技术 核酸凝胶电泳技术 聚合酶链式反应技术 实时定量PCR技术 基因组文库构建技术 DNA疫苗 RNA干涉技术 酶联免疫技术一、核酸凝胶电泳技术按分子量大小分离DNA，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。基本原理：生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（EtBr）染料对核酸分子进行染色。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。二、聚合酶链式反应技术PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。PCR能够在体外快速、特异性的扩增靶DNA，已成为当今最重要的分子生物学技术之一。法医物证应用PCR技术扩增人类基因组DNA中高度多态性位点，扩增产物经过片段长度多态性分析或序列多态性分析研究不同个体间DNA分子水平上的差异及其遗传规律，在个人识别、亲子鉴定中发挥了重要作用。 PCR 反应的一次循环：第一步 9498 高温条件下，DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA 。第二步 5060温度下，引物DNA与DNA模板上的一小段片段配对结合。第三步 72温度下，由DNA聚合酶催化，从引物开始由53的方向延伸合成目的基因 。试剂10PCR缓冲液(10Buffer) 4dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP) Tag酶DNA模板引物1: 5- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3引物2: 5-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3 反应体系 在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系：PCR反应程序(1) 94变性5min(2) 94变性1min (3) 52 退火1min(4) 72 延伸1min。(5) 重复(2)-(4)30次(6）72 延伸1min。实验仪器 PCR仪 移液器 电泳仪 琼脂糖凝胶电泳槽DNA亲子鉴定技术亲子鉴定原理鉴定假设父和孩子是否亲生关系 首先从母、子基因型对比中，确定孩子基因中可能来自父亲的基因。然后观察假设父亲的基因型，如果不具有生父基因，则可排除假设父与孩子的亲生关系。若假设父也具有生父基因，结果就不能排除假设父的亲生关系。核DNA-STR鉴定STR：短串联重复序列(Short tandem repeat)，由2-6bp重复单位构成，通常扩增获得的多态性长度片段范围在100-400bp之间。STR基因座广泛存在于哺乳动物基因组中，以人类基因组为例，平均每15-20kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约有5万到10万个STR位点。由于STR位点具有高度的多态性和稳定的遗传性，因此较适合于作为遗传学DNA分子标记，目前STR分析已广泛应用于遗传制图、性状连锁性分析、亲子鉴定、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域。细胞核DNA-STR的遗传，遵循孟德尔分离定律（Y染色体STR检测除外）。对于直系亲属的鉴定，目前国际上通用的是核STR鉴定，准确率可达99.99%，可以达到直接认定的作用。但由于核DNA的结构和数量等特点，对于各种陈旧的血痕、骨骼或牙齿，或者一些高度腐败的肌肉或组织，检测结果通常是不理想的。对于不适于做常染色体STR的检材，可以选择线粒体作为检测标记。线粒体DNA不易断裂和降解，而且拷贝数多，就是对于高度降解的检材也易于扩增。因此对于年代非常久远的骨骼，甚至是上千年古尸的骨骼，都可以采用线粒体进行家族、家系的鉴定。由于线粒体具有母系遗传的特性，可以鉴定来自于同一母系的人群。由此，科学家们推测世界上不同民族都起源于非洲，而且来自于同一个非洲母亲。三、实时定量PCR技术通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 。荧光定量PCR与常规PCR的区别常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析荧光定量PCR技术： 对PCR反应中每一个循环的产物进行定量分析实时荧光定量PCR的特点 异性更强 灵敏度高 可直接对产物进行定量 解决PCR污 染问题 自动化程度高 操作简单一般而言，荧光扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。实时荧光定量PCR技术中的一些重要因素：Ct值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。 Ct value 荧光定量PCR的应用对各种基因表达进行定量分析基础研究：不同组织、用药前后、不同发育阶段基因表达差异的检测临床：细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测DNA、mRNA病毒荷载量的定量，肿瘤相关基因、肿瘤标志物和肿瘤耐药基因的检测食品卫生检疫：转基因食品瘟疫流行地区进口的食品点突变分析和等位基因分析 单核苷酸多态性（SNP）分析 DNA甲基化检测 设计荧光定量PCR实验方案根据仪器和个人喜好确定荧光定量PCR的方法，选择荧光素种类;合成引物和探针;收集样品、提取RNA或DNA（-80保存，避免反复冻融 ）;制备标准品（质粒、化学合成的目的基因）拷贝数=质量分子量6.01023标准曲线通常由45个点组成;RT反应不加探针的常规PCR反应，验证引物是否合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。同时确定最佳反应体系和反应条件每次实验都设置阴性对照和标准品，每个样品设两个平行孔常用的荧光定量PCR试剂 SYBR Green I Taqman水解探针 分子信标SYBR Green 法工作机理SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位;SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光;变性时，DNA双链分开，无荧光;复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green I的特点可以用于不同的模板 使用方便 价格相对便宜 灵敏度很高与非特异性产物结合 解离曲线 选择良好的引物和探针并优化反应条件 TaqMan Probes工作原理TaqMan 法工作原理 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号。可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan MGB探针 MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 分子信标 (发夹型杂交探针);分子信标能特异性地检测感兴趣的目标DNA;分子信标可用于单核苷酸多态性的检测;特别适用于检测点突变只能用于一个特定的目标;设计困难;价格较高实时荧光定量PCR法举例TaqMan法研究ERBB2 在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异标记探针 使用 TaqMan探针进行双通道荧光定量（Fam标记目标基因，VIC标记看家基因）材料准备 分别从正常乳腺组织和乳腺癌组织中提取总RNA;用含 ERBB2 和 GAPDH 的质粒生成标准曲线;单双通道同时进行，独立分析no RNA：阴性对照RNA + no reverse transcripta