江苏省徐州市王杰中学高三生物总复习 生物化学与分子生物学技术实践导学案 苏科版.doc

江苏省徐州市王杰中学高三生物总复习 生物化学与分子生物学技术实践导学案 苏科版【学习要求】蛋白质的提取和分离（a）【知识梳理】1凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同。相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速率 。 2缓冲溶液作用是 。3电泳是指 。 电泳利用了待分离样品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是 和 。在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。4蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。5样品处理(1)红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放：在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第1层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。(4)透析：取1 ml的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300 ml的物质的量的浓度为20 mmoll的 中，透析12 h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的 。6凝胶色谱操作：首先要制作 ；第二步是 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不 得 有 存在，避免降低分离效果；第三步是 。【课时练习】1相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 ( )2蛋白质提取和分离分为哪几步 ( ) a样品处理、凝胶色谱操作、sds一聚丙烯酰胺凝胶电泳 b样品处理、凝胶色谱操作、纯化 c样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 d样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定3将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 rmin的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是 ( ) a血红蛋白、甲苯层、脂类物质层、沉淀层 b甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂类物质层 c脂类物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层 d甲苯层、脂类物质层、血红蛋白、沉淀层4下列操作正确的是 ( ) a分离红细胞时采用低速长时间离心 b分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 c红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 d透析时要用20 mmoll的磷酸缓冲液，透析12 h二、多选题5凝胶色谱操作不正确的是 ( ) a将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 b将橡皮塞下部用刀切出凹穴 c插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 d将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片6选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列不是其优点的是 ( ) a血红蛋白是有色蛋白 b红细胞无细胞核 c红细胞蛋白质含量高 d红细胞dna含量高 7下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是 ( ) a采集血样后要高速短时间离心获得血细胞 b洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净 c在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白 d释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来三、简答题8红细胞含有大最血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携o2或co2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：(1) 实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。 以上所述的过程即样品处理，它包括 、 、收集血红蛋白溶液。 (2) 收集的血红蛋白溶液在透析袋中经过透析，这就是样品的粗分离。 透析的目的是 。 透析的原理是 。(3) 通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经sds一聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 样品纯化的目的是什么? 。附参考资料：蛋白质的分离与纯化（苏教）蛋白质存在于生物体的组织细胞中，不同的生物体组织细胞所含的蛋白质种类、数量也不尽相同。要研究某种蛋白质的结构、性质和功能，就必须将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。因此，蛋白质的分离与纯化技术便成为蛋白质研究的重要技术。 在分离与纯化蛋白质之前，必须采用适当的方法使蛋白质呈溶解状态释放出来。通常先将生物组织进行机械破碎，再根据细胞的结构特点，选择不同的破碎细胞方法(常用的有研磨法、超声波法、酶解法等)破碎细胞，待细胞破碎后，各种蛋白质被释放出来，再根据蛋白质的不同特性，选择不同的溶剂进行抽提。例如，酸性蛋白质可以用稀碱性溶液抽提，水溶性蛋白质可以用透析液(中性缓冲液)抽提，脂溶性蛋白质则可以用有机溶剂抽提等。抽提出来的粗提取物，经过离心去除固体杂质后，再通过物理学和化学的方法处理，即可得到蛋白质的粗制品。 蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物，其中还可能混有许多小分子化合物，所以必须进一步纯化。纯化主要是根据蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度、所带电荷的多少、吸附性质等方面存在的差异进行的。例如，利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可采用透析法(图4一1)使蛋白质与其他小分子化合物如无机盐、单糖、双糖、氨基酸等分离开来。常用的半透膜有天然的如肠衣，人工合成的如玻璃纸等。在透析时将待纯化的蛋白质溶液装入用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液中便可进行透析。又如，离心沉降法也是纯化蛋白质的一种方法，它通过控制离心速率，使得分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同种类蛋白质的目的(图4-2)。 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。电泳现象早在19世纪就被发现了，而电泳技术的广泛应用却始于20世纪40年代。目前，电泳技术已成为生物科学研究以及医、农、林、牧、渔、制药等领域必不可少的分析手段。不同的物质在同一电场中的泳动速度不同。泳动速度主要取决于带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少。一般来说，带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中泳动速度越快；反之，则越慢。此外，电场强度、溶液的ph等因素对泳动速度也有影响。支持物电泳是目前应用较为普遍的纯化蛋白质的一种方法，支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法具有简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样品用量少：没有吸附现象、电泳后区带界限清晰等优点，已广泛应用于科学实验、临床化验和生化产品分析(如血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白等的分离和鉴定)等方面。血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 1配制试剂：按照试剂配方(见第62页“附录”)，选择相应的化学试剂，配制巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等。 2架滤纸桥：按照支架的大小裁剪合适的滤纸条，取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐，另一端浸入电泳槽的缓)中液，待滤纸条湿润后，驱除气泡，使滤纸紧贴于支架上，即是滤纸桥(图4-3)。 3浸泡薄膜：用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做上记号，然后放在巴比妥缓冲液中浸泡20 min(图4-4)。 4细心点样：取出薄膜，吸去多余的液体，平铺在玻璃板上，有记号的一面朝下。点样时用盖玻片在血清中蘸一下，在离薄膜一端23 cm处轻轻按下，随即提起(图4-5)。5平悬薄膜：用镊子夹取薄膜将点样端平贴在电泳槽负极支架的“滤纸桥”上，有记号的面朝上，另一端平贴于正极，呈绷直状态(图4-6)。6实施电泳：盖上电泳槽盖，在薄膜平衡约l0min后通上电源，电压调至160 v，膜宽电流强度0408 macm，电泳时间6090 min(图4-7)。 7染色：电泳完毕后取下薄膜，放入染色液中浸泡l0 min。 8漂洗：从染色液中取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区底色脱净为止，即可得到色带清晰的电泳图谱(图4-8)。9脱色：用滤纸压平并吸干薄膜后，再浸入透明液中约5 min，取出后平贴于玻璃板上，待完全干燥后便成透明膜，