机能试验册.doc

实验一 家兔高钾血症及其抢救 【实验目的】 1. 通过静脉给钾，复制家兔高钾血症的动物模型。 2. 观察高血钾时心电图的异常改变。 3. 了解高血钾时，钾对心肌细胞的毒性作用，并自行设计高钾血症反应时的抢救方案 【实验原理】 高血钾可使心脏有效不应期缩短，兴奋性和传导性呈双相变化。血钾急剧增高时，由于严重传导阻滞和兴奋性消失而导致心跳停止。本实验旨在通过静脉给钾，复制高血钾症，通过观测心电图变化，了解高血钾症对心脏的影响。 【实验对象】 家兔（雌雄不限） 【仪器与药品】 婴儿秤，兔固定台。心电图机，心电示波记录仪，离心机，火焰光度计。 20% 乌拉坦， 5% 及 10% 氯化钾。 4% 碳酸氢钠， 10% 氯化钙，葡萄糖 - 胰岛素溶液，肝素 - 生理盐水溶液。 小儿头皮针， 5ml 、 20ml 注射器， 5ml 抗凝试管。手术器械一套。 【步骤与方法】 1. 取家兔一只称重，耳缘静脉缓慢推注 20% 乌拉坦（ ml/kg 体重）全麻。 2. 仰卧固定于兔台上，剪去颈部背毛。做颈部正中纵行切口，长约 68cm ，依次打开肌肉组织，小心分离一侧颈总动脉并插管保留，然后采血 ml 用于测定实验前的血钾浓度。 3. 在心电图机导联线原有的电极杆上外包 23 层固定电线用的铝皮，并与 6 号针头紧连（固定要紧勿松动），将改装后的电板针头分别贯穿插入家兔四肢踝部皮下，勿插入肌肉中防止肌颤的干扰。导联线的联接方法，按右前肢（红），左前肢（黄），右后肢（黑），左后肢（绿）的顺序联接。 4. 打开心电示波器观察心电图，选择 T 波低于 0.15mV 的导联，（常用或 avF 导联），若 T 波高于 0.15mV ，改用其它导联或更换其它动物。为获得更为高大清晰的心电图波形，可用头胸导联。方法是将心电图机上的导联旋钮旋转到导联位置，把右前肢电板插在下颏部皮下，左前肢的电扳插在相当于心尖部的胸壁上，这样可较早清晰地获得高血钾心电图的异常波形。 5. 按动物心电图的常规操作（即记录纸速度每秒 25mm ，每 1mV 电压基线移位 1cm ）记录一段正常心电图。记录纸长以每人能得到 46 个心跳为度。 6. 在家兔耳缘静脉上插入小儿头皮针，并用胶布固定好，头皮针与装有 5% 氯化钾的注射器相联，以每分钟 0.5ml 速度缓慢推注氯化钾，每公斤体重 1ml 。每隔 5 分钟再推同等剂量氯化钾，注射氯化钾的过程中，由示波器观察心电图波形的变化规律。出现波低平增宽， QRS 波群低压变宽和高尖波时，开动心电图机描记。 7. 观察到高血钾的心电图异常改变后，再推注 10% 氯化钾（ 3ml/kg.bw ），出现心室扑动或颤动后立即停止注射。同时，从颈总动脉插管取血 1ml ，测定血钾浓度。从另一侧耳朵的耳缘静脉上分别推注拮抗剂（小组讨论后决定采用 4% 碳酸氢钠 5ml/kg.bw 、 10% 氯化钙 2ml/kg.bw 或葡萄糖 - 胰岛素溶液 7ml/kg.bw ），待心室扑动或颤动波消失，心电图基本恢复正常时，再次由颈总动脉采血 1ml 测定救治后的血浆钾的浓度。最后注入致死剂量的 10% 氯化钾，边注射边观察心电示波形的改变，出现室颤时，快速打开胸腔观察心室纤颤及心脏停跳情况。 【注意事项】 1. 推注麻醉剂时宜慢，达到满意麻醉效果（如四肢松驰）时，停止给药。余量视动物反应情况随时随补充。 2. 动脉取血时，应紧贴试管壁放血，这样可减少红细胞的破坏，试管应保持干燥清洁，血液凝固后应立即分离血清。颈总动脉取血后，均用肝素生理盐水溶液 2ml 冲洗管道内的余血，防止导管内血液凝固。 3. 实验前稳妥地接好心电图机的地线，实验中以心电示波观察，必要时打开心电图记录装置，防止热笔因长时间处于工作状态造成电针温度过高，烧坏记录纸张。针型电极剌入部位要对称，位于皮下，导线避免纵横交错，实验台上的液体要及时擦拭干净。如家兔 T 波高出正常值 0.5m 或融合在 S-T 段中不呈现正常波形，应更换导联，如用头胸导联，否则更换动物。 4. 耳缘静脉注入氯化钾溶液，注意滴入速度，注入速度不宜太快，也不宜太慢，要随时观察各项指标的变化。当各项指标急剧变化时，应减慢速度。防止滴入速度太快导致动物突然发生心室纤颤而死亡，动物对注入氯化钾溶液耐受性有个体差异，有的动物需注入较多的氯化钾才出现异常心电图改变，遇到这种情况时，应适当调整注入氯化钾的浓度和间隔时间。 【附录】血钾测定法 1. 火焰光度法 原理： 此法是一种发射光光谱分析，被测溶液经压缩空气后，喷雾状后，与可燃气体混合燃烧成火焰，火焰激发后各光素发射出特有的光谱。钾的波长为 765nm ，光谱呈红色，溶液中钾浓度越高，发射出的光谱越强，因此在一定激发条件下，钾浓度与火焰光度计检流计的读数成正比。通过与已知标准液的比较，可求得溶液中钾的浓度。 试剂配制 （ 1 ）钾标准贮存液（ 10mmol/L ）：取氯化钾数克，置量瓶内，在 120 烤箱中恒重，取出放入玻璃干燥器内冷却至室温后，准确称取 0.746g 。用重蒸馏水溶解，移入 1000ml 容量瓶中，再以重蒸馏水稀释至 1000ml 刻度处，存放于塑料瓶中，冰箱内保存备用。 （ 2 ）钾标准应用液（ 0.04mmol/L ）：取钾标准贮存液 4ml ，以重蒸馏水稀释 1000ml ，放塑料瓶中备用。 测定步骤 （ 1 ）血清的稀释：取血清 0.1ml 置于 150mm15mm 试管内。加重蒸馏水 9.9 ml ，充分混匀。 （ 2 ）安装：调好仪器，将钾滤色片置于光路中，把样液吸入试管放入钾标准液内，待火焰呈黄色后，开启快门，移动光栅。使检流计读数控制在 80100 之间，作为钾标准读数，并关闭快门。 用重蒸馏水喷雾洗涤至火焰恢复到空白时所呈的蓝紫色。将样液吸入管放入稀释血清（ 1/100 ）中，待火焰呈黄色后，开启快门，记录检流计上的读数（钾样读数）。关闭快门。依上法用重蒸馏水喷雾洗涤至火焰恢复到蓝紫色。 计算方法 钾测定读数 0.04100= 钾测定读数 4=mmol/L 钾标准读数 钾标准读数 2. 四苯硼化钠比浊法： 原理： 无蛋白血滤液中钾离子与四苯硼化钠作用，形成难溶于水的四苯硼化钾的混浊液，用光电比色计比浊测定其含量。 试剂准备 （ 1 ） 0.2mmol/L 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（ Na 2 HPO 4 12H 2 O ） 7.160g ，溶于 100ml 蒸馏水中。 （ 2 ） 0.1mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸（ C 3 H 4 (OH)COOH 3 H 2 O ， AR ） 2.10g ，溶于 100ml 蒸馏水中。 （ 3 ） 1% 四苯硼化钠液：取 0.2mmol/L 磷酸氢二钠 19.45ml 及 0.1mmol/L 柠檬酸液 0.55ml 于 100ml 量筒中混合。再加入四苯硼化钠 1g ，待溶解后加水至 100ml 。 （ 4 ）蛋白沉淀剂：量取 0.1mol/L H 2 SO 4 800ml ， 10% 钨酸钠 100ml ，浓磷酸 0.3ml 混匀，溶液放置，如果发混即需另配。 （ 5 ）钾标准贮存液（ 5mmol/L ）：称取纯氯化钾在 120 烘干恒重后，称取 373mg 加蒸馏水溶解，稀释至 1000ml 。 （ 6 ）钾标准应用液（ 0.5mmol/L ）：取贮存液 10ml 加水至 100ml 。 操作步骤 （ 1 ）无蛋白血滤液制备：取血清 0.5ml ，加蛋白沉淀剂 4.5ml 混匀，沉淀后取滤液备用。 （ 2 ）血钾测定操作步骤 试 剂 标准 (S) 测定 (R) 空白 (B) 蒸馏水 1.0ml 无蛋白滤液 1.0ml 钾标准液 1.0ml 1% 四苯硼化钠 4.0ml 4.0ml 4.0ml 上述试剂混匀， 5 分钟后用波长 520 nm 滤光片，于光电比色计中比浊。以蒸馏水调节“ 0 ”点。 （ 3 ）计算： （ R B ） 0.5 1 =mmol/L （ S B ） 0.1 正常值：血清钾 3.55.6mmol/L 注意事项 1. 标本切忌溶血，因红细胞内钾含量高。 2. 血液凝固后，应立即分离血清，以免细胞内钾离子逸出。 3. 四苯硼化钠必须提纯。提纯方法为：（ 1 ）将氯仿置 50 左右水浴中加温 1520min ，然后称取待提纯的四苯硼化钠 10g 于 100ml 烧杯内。加入已温热的氯仿 50ml 左右，搅匀，使成混悬液；（ 2 ）将混悬液倒入玻璃砂心漏斗内，立即置抽滤瓶上抽滤至干；（ 3 ）再加约 50ml 热氯仿于烧杯内，将杯内残存的四苯硼钠洗下，洗液一并倒入玻璃砂心漏斗内，抽滤至干；（ 4 ）直接向漏斗内加入热氯仿 3040ml ，抽滤至干，并重复 23 次；（ 5 ）最后加入 3040ml 乙醚于漏斗内，迅速抽滤至干，重复洗涤 23 次；（ 6 ）取下漏斗，立即置 40 左右干燥箱内，烘 23h ，使其尽快干燥。 【讨论思考题】 1. 碳酸氢钠、氯化钙、葡萄糖 - 胰岛素溶液抢救高钾血症的原理是什么？它们是否都能降低血钾的浓度？ 2. 注射氯化钾后，心电图有何异常变化，它们的发生机制是什么？ 3. 放置血液的试管，为什么应保持干燥清洁？ （史满金） 实验二 家兔实验性肺水肿 【实验目的】 1. 掌握肺水肿动物模型复制方法。 2. 观察肺水肿时呼吸、心率、中心静脉压的变化及典型体征。 3. 通过实验加深对肺水肿发生机制的理解。 【实验原理】 水肿的发生与影响血管内外液体交换的因素（如流体静压、胶体渗透压及血管通透性）改变有密切关系，即血管内流体静压升高，血浆胶体渗透压下降及血管通透性增高均可促使水肿发生。当大量快速输液时，血容量明显增加，血液稀释而致血管内流体静压上升，胶体渗透压下降，有利于水肿的发生。在此基础上，输注肾上腺素，可引起外周血管广泛收缩，导致血液由体循环急速转移到肺循环，加之毛细血管通透性增高，未能为左心所代偿，结果使左心房压力和肺毛细血管流体静压突然升高，液体进入肺泡及间质增多，影响肺呼吸功能，而出现肺水肿。 【实验对象】 家兔 【器械与药品】 常规手术器械，气管插管，婴儿秤，听诊器，天平，兔固定台。 20ml 注射器，输液装置， PcLab 生物信号采集系统，压力换能器，滤纸，烧杯，丝线，粗棉线。 20% 乌拉坦，注射用肾上腺素。 【步骤与方法】 1. 取家兔一只，称重后经耳缘静脉注入 20% 乌拉坦 5ml/kg.bw 进行全身麻醉，然后固定在家兔固定台上。 2. 剪去颈部兔毛，在颈部正中做长 6cm 的纵切口，钝性分离气管和一侧的颈总静脉。在气管上做倒 “T” 字形切口，切开气管，插入气管插管，用粗棉线结扎固定，然后将气管插管的一端与压力换能器相连并连接在微机记录系统上，描记呼吸曲线。结扎颈总静脉远心端，在近心端剪一小口，然后插入连有输液装置的静脉插管，打开输液装置检查是否通畅，然后将输液滴数调到 1015 滴 / 分，以防止血液凝固。 3. 打开微机进入 PcLab 生物信号采集系统，按 PcLab 常规操作进行通道和零点设置，然后描记正常呼吸曲线。观察呼吸、心率、中心静脉压的变化，并用听诊器听诊正常呼吸音。 4. 由输液装置输入生理盐水，输液量按 100ml/kg.bw 计算，输液速度控制在 150180 滴 / 分，输完后，将 0.1% 肾上腺素以 0.5mg/kg.bw 计算，用生理盐水稀释 10 倍后加入输液瓶中，继续滴注。肾上腺素输完后，可给少量生理盐水，以 1015 滴 / 分速度维持通道，以便必要时第二次给药。观察呼吸、心率、中心静脉压的变化。 5. 输药过程中，应密切观察呼吸曲线的变化，有无呼吸急促、呼吸困难，听诊有无湿罗音，气管插管口有无粉红色泡沫痰溢出。如无以上肺水肿的典型表现，可重复使用肾上腺素，用法剂量同上，直至出现以上变化为止。 6. 当动物出现肺水肿典型表现时，用止血钳夹闭气管，剪开胸前壁，然后用粗棉线在气管分叉处结扎，防止水肿液溢出，小心分离心脏和血管，将肺取出，用滤纸吸干肺表面水分后，准确称取肺重量，计算肺系数。肺系数 = 肺重量（ g ）体重（ kg ）。正常肺系数为 45 。 7. 肉眼观察肺大体变化及双肺底有无淤血发生，然后用刀片切开肺组织，观察挤压时是否有水肿液溢出（注意其量、性质、颜色）。 8. 另取家兔一只，称重麻醉后固定于兔台上，进行颈部手术，实验步骤和方法条件同前一只家兔，但不使用肾上腺素。比较两只动物的表现有何不同。 9. 整个实验过程中，呼吸、心率、中心静脉压等指标需观察三次，分别在实验开始后、输完肾上腺素后及泡沫痰溢出时进行观察。 10. 切片观察：取以往做好的肺水肿病理切片，放置在显微镜下进行低倍、高倍观察，了解肺水肿的病理变化。 【注意事项】 1. 注射乌拉坦麻醉时速度要慢，否则容易造成动物死亡。 2. 不能使用实验前有肺水肿指征（罗音、喘息、气促）的动物，否则会影响实验结果。 3. 插完静脉插管后，应马上以 1015 滴 / 分速度输液，这样可以防止静脉插管内凝血。 4. 控制好输液速度和输液量，过慢时实验组和对照组均不发生肺水肿，而过快时对照组也会发生肺水肿。 5. 如一次给肾上腺素肺水肿指征不明显需重新给药时，两次间隔宜在 1015 分钟，不易过频。 6. 取肺时要小心，防止肺组织破裂和水肿液流出，否则影响肺系数的准确性。 【附录】 （一）中心静脉压测量方法 1. 将颈静脉插管经三通管与输液瓶和水检压计相连（输液瓶可用 50ml 注射器代替）。 2. 先使输液瓶与水检压计相通，让盐水充满水检压计，检压计零点与动物右心房处于同一水平（向水检压计充盐水时，可先将检压计倒置，待气泡排出后再翻转水检压计，这样可排净检压计中的气泡）。 3. 将水检压计与颈总静脉相通，检压计内液面开始下降，当液面不再继续下降而随呼吸上下波动时，此时的液面刻度即为中心静脉压的值。 4. 测完压力后，阻断与检压计相通的侧管，使输液瓶与静脉导管相通，继续缓慢输液（输液速度为 1015 滴 / 分），维持管道通畅。 （二）大鼠实验性肺水肿 大鼠注入生理盐水和肾上腺素后，引起外周血管广泛收缩，导致血液由体循环急速转移到肺循环，加之毛细血管通透性增高，未能为左心所适应，结果使左心房压力和肺毛细血管流体静压突然升高，液体滤入肺组织增多，随后出现肺水肿。其具体方法是： 1. 大鼠称重后，用 20% 乌拉坦（ 0.5ml/100g.bw ）腹腔注射麻醉，或 1% 戊巴比妥钠（ 0.5ml /100g.bw ）肌肉注射全身麻醉，然后将大鼠仰卧位固定于手术台上。 2. 剪去颈部手术区的鼠毛，做颈部正中纵切口（长 2cm ），细心分离气管，左侧颈总动脉及右侧颈总静脉，穿线备用。 3. 在气管上做倒“ T ”字形切口，切开气管，插入气管插管，用粗棉线结扎固定，然后将气管插管的一端与压力换能器相连并连接在微机记录系统或二道生理记录仪上，描记呼吸曲线。 4. 结扎颈总静脉远心端，在近心端剪一小口，然后插入静脉插管（静脉插管内要充满 0.1% 的肝素化生理盐水）结扎固定，注入 0.5% 肝素（ 0.1ml 100g.bw ）抗凝，用丝线结扎颈总动脉远心端，动脉夹夹闭近心端，插入充满 0.1% 肝素的动脉插管结扎固定，将动脉插管经压力换能器连于记录仪或微机系统上，记录一段正常血压曲线。 5. 动物分为实验组和对照组两组。实验组大鼠经颈总静脉注入生理盐水（ 0.3ml/100g.bw ）后，接着较快推注 0.01% 的肾上腺素（ 0.1ml/100g.bw ）。对照组注入生理盐水，不推注肾上腺素。观察动物的表现（呼吸情况及呼吸音的改变，气管插管处有无粉红色泡沫痰溢出）及存活时间。 6. 动物死亡或处死后，用止血钳夹闭气管，剪开胸前壁，然后用粗棉线在气管分叉处结扎，防止水肿液溢出，小心分离心脏和血管，将肺取出，用滤纸吸干肺表面水分后，准确称取肺重量，计算肺系数。 7. 肉眼观察肺大体变化及双肺底有无淤血发生，然后用刀片切开肺组织，观察是否有水肿液溢出（注意其量、性质、颜色）。 【讨论思考题】 1. 本实验中为什么要大量快速输液？ 2. 输入肾上腺素导致肺水肿的机制是什么？ 3. 实验中为什么会出现粉红色泡沫痰？ 4. 输入肾上腺素为何会出现呼吸抑制甚至暂停？ 5. 本实验中如果输液过快过多对实验结果有何影响？ （刘艳凯 张学锋） 实验三 小鼠实验性缺氧 【实验目的】 1. 掌握各型缺氧动物模型的复制方法。 2. 观察缺氧时呼吸系统的改变及血液颜色的变化。 3. 了解环境温度改变对缺氧的影响。 4. 了解中枢神经系统机能状态改变时机体对低气压所致缺氧耐受性的影响 。 【实验原理】 缺氧是临床上常见的病理过程，根据其原因不同可分为乏氧性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧及组织性缺氧四种类型。引起乏氧性缺氧的常见原因有大气中氧分压降低和呼吸系统疾病，其共同特征是动脉氧分压、氧含量、血氧饱和度均降低，实验中将小白鼠放入装有钠石灰的密闭缺氧瓶内，造成吸入气氧分压降低，从而引起乏氧性缺氧。血液性缺氧是由于血红蛋白性质和含量改变所致的缺氧，本实验利用一氧化碳和亚硝酸钠中毒的方法，使血红蛋白失去携氧能力，从而引起血液性缺氧，其中亚硝酸钠中毒所形成的高铁血红蛋白，可被还原剂美蓝还原成正常血红蛋白，恢复带氧能力，达到抢救和预防的目的。机体对缺氧耐受性受多种因素影响，本实验将探讨环境温度改变和中枢神经系统机能状态改变对缺氧耐受性的影响，当环境温度升高、中枢神经系统兴奋时，机体代谢率增高，单位时间内耗氧量增加，对缺氧耐受性降低；反之，机体对缺氧耐受性增强。 【实验对象】 小鼠 【器械与药品】 小白鼠缺氧瓶，一氧化碳发生装置，广口瓶， 5ml 刻度吸管， 1ml 注射器，酒精灯，剪刀，镊子，蜡盘，小天平，负压吸引器（或抽气机）。 钠石灰，甲酸，浓硫酸， 5% 亚硝酸钠， 1% 美蓝， 1% 咖啡因， 0.25% 氯丙嗪，生理盐水，碎冰块。 【步骤与方法】 为便于实验操作，取 10 只小鼠，从 110 进行编号，然后按以下步骤进行操作： 1. 各型缺氧的观察： （ 1 ）乏氧性缺氧：取 1 号小鼠及 5 克钠石灰放入缺氧瓶中，盖紧瓶塞，复制乏氧性缺氧。观察动物的一般情况、呼吸频率、鼠尾及口唇颜色。每 3 分钟重复观察上述指标一次，直至动物死亡为止，记录存活时间。 （ 2 ）一氧化碳中毒性缺氧：取 2 号小白鼠放入广口瓶中，并与一氧化碳发生装置相连（图 7-3-1 ），然后将 3ml 甲酸与 2ml 浓硫酸放于一氧化碳发生装置的锥形瓶中，塞紧后用酒精灯加热（加热时不可过热以致液体沸腾，因为一氧化碳产生过多过快时动物迅速死亡，血液颜色改变不明显），观察指标同上。 （ 3 ）亚硝酸钠中毒性缺氧：取 3 、 4 号小鼠，观察正常表现后，分别向腹腔注入 5% 亚硝酸钠 0.3ml ，其中 3 号注入亚硝酸钠后，立即腹腔注射 1% 美蓝溶液 0.3ml ， 4 号注入生理盐水 0.3ml 。观察指标与方法同上，比较两只小鼠的表现及存活时间。 图 7-3-1 CO 发生装置 2. 环境温度改变对缺氧耐受性的影响： （ 1 ）取两个氧瓶，各放入钠石灰 5 克。 （ 2 ）取 500ml 烧杯两个，一个加入碎冰块，将杯内水温调制 0-4 ，另一个加入热水，将温度调制 4042 。 （ 3 ）取 5 、 6 号两只小白鼠，称重后装入两个缺氧瓶内，盖紧瓶塞，然后将两个缺氧瓶分别放于装有碎冰和热水的烧杯内（高温组小鼠缺氧瓶也可直接放于 4042 恒温水浴锅内）。 （ 4 ）观察动物的一般状态和存活时间，并与室温条件下的 1 号小鼠进行对比。 3. 中枢神经系统状态对低气压所致乏氧性缺氧耐受性的影响： （ 1 ）取 7 、 8 、 9 号三只小鼠，于抽气前 10 分钟分别腹腔注射 1% 咖啡因、 0.25% 氯丙嗪、生理盐水 0.3ml 。 （ 2 ）将三只小白鼠放入负压吸引器的低压槽内，密闭容器。 （ 3 ）打开负压吸引器电源，抽气减压，从压力表上观察，减压速度为每分钟上升 2000m ，模拟高度，直至 9000m （高度与大气压的关系见表 7-3-2 ），自减压开始记录时间，直至小鼠死亡，观察各组动物的一般表现，记算存活时间。 4. 肝脏颜色的观察： 将 10 只小白鼠（未死者处死）按顺序放于蜡盘中，用剪刀剪开腹部并向上翻起腹壁，暴露肝脏，观察肝脏颜色变化。 图 7-3-2 高度与大气压关系图 【注意事项】 1. 缺氧瓶内外表面要干净透明，以利观察动物在瓶内的表现。 2. 必须保证缺氧瓶完全密闭，否则会影响实验结果。 3. 给小白鼠腹腔注药时要稍靠右下腹，勿损伤肝脏，也不要将药注入肠腔或膀胱。 4. 测量耗氧量前，高、低温环境中的两只缺氧瓶必须在室温下平衡 15 分钟左右。 【附录】 用测氧仪测小白鼠耗氧率的方法 1. 按测氧仪说明书安装电极，检查电池电压，调整极化电压和调节零点。 2. 将已安装好的氧电极插入仪器的“输入”孔，进行电极的灵敏度调节，校正零点。然后用干燥氮气调节灵敏度至刻度 21% 。重复以上动作 12 次，使重现性误差小于读数误差的 2.5% 。 3. 将缺氧瓶塞上的一个橡皮管同测瓶内空气容积装置相连，装置内的水即因负压而进入缺氧瓶内。然后将另一橡皮管同测氧仪的电极进样管相连，并从电极出样管缓慢抽气，使缺氧瓶内气体缓慢进入测氧仪的测量池。当测氧仪表头指针稳定后，直接读取瓶内空气剩余氧浓度（ C ）。 4. 将缺氧瓶塞上的两个橡皮管全部打开，用 50ml 注射器向其中一管注入水，当水充满缺氧瓶时，将缺氧瓶内水倒入量筒内，读取液面刻度即为缺氧瓶内空气容积（ B ）。 5. 用测氧仪测得瓶内空气的剩余氧浓度（ C ）和用测瓶内空气容积装置测出瓶内空气容积（ B ），求总耗氧量（ A ）： A(ml)=(20.94%-C) B 。 6. 根据小白鼠体重（ W ），存活时间（ t ），总耗氧量（ A ），计算小白鼠耗氧率（ R ）（每分钟 ml/g ）： R(ml/g.min)=A 体重（ g ）存活时间 t （ min ）。 【讨论思考题】 1. 一氧化碳中毒和亚硝酸钠中毒性缺氧血液颜色有何异同 ? 2. 在乏氧性缺氧实验中，如果缺氧瓶中不加钠石灰对实验结果有何影响 ? 3. 通过本实验解释低温麻醉的原理 ? 4. 在高原环境中机体对缺氧有何代偿反应 ? （刘艳凯 张学锋） 实验四 家兔失血性休克及其抢救 【实验目的】 1. 掌握失血性休克动物模型的复制方法。 2. 观察失血性休克时机体的一般状态及呼吸、血压、心率、中心静脉压、尿量的变化，了解失血性休克的病理生理过程。 3. 了解失血性休克的抢救原则和抢救方法。 【实验原理】 失血性休克是临床上常见的急症，由于血容量减少，机体有效循环血量降低，从而使机体重要脏器血液灌流减少，而微血管的持续收缩与痉挛又加重了器官的缺血，使器官功能进一步障碍。本实验采用颈总动脉放血方法，造成机体有效循环血量减少，复制失血性休克。通过实验进一步了解失血性休克时心、肺、肾等器官的功能障碍，加深对失血性休克的认识。由于微循环障碍是失血性休克的基础，治疗的主要措施就是改善微循环灌流，因此，实验中采用回输血液及输入生理盐水方法来改善微循环灌流状态，对失血性休克进行抢救。 【实验对象】 家兔 【器械与药品】 常规手术器械，气管插管，动脉套管，动脉夹，婴儿秤，兔固定台， 5ml 、 20ml 、 50ml 注射器，输液装置，水检压计，二道生理记录仪，导尿管，压力换能器，压力定标装置，滤纸，烧杯，丝线，粗棉线。 20% 乌拉坦， 1% 肝素， 3.8% 枸橼酸钠，生理盐水。 【步骤与方法】 1. 家兔称重后，自耳缘静脉注射 20% 乌拉坦 5ml/kg.bw 进行全身麻醉，然后将家兔仰卧位固定于兔台上。 2. 剪去颈部兔毛，沿甲状软骨下缘正中做长 6cm 纵切口，用止血钳钝性分离气管、左侧颈总动脉及右侧颈总静脉，在气管上做倒“ T ”字形切口，插入气管插管，用粗棉线结扎固定，然后与换能器和记录仪相连，描记呼吸曲线。 3. 自耳缘静脉输入 1% 肝素 1ml/kg. bw 抗凝后，用丝线结扎颈总动脉远心端，动脉夹夹闭近心端，插入充满枸橼酸钠的动脉套管结扎固定，将套管一端连于压力换能器，经记录仪记录血压，另一端备放血用。 4. 输液装置内加入生理盐水 200ml ，排净输液管道及水检压计内的气泡，结扎颈总静脉远心端，插入与输液装置及水检压计相连的静脉插管，检查通畅后以 1015 滴 / 分速度缓慢输入生理盐水，以确保管道通畅。 5. 在耻骨联合上做腹部正中切口长约 5cm ，找出膀胱，排空尿液后，将膀胱从腹腔拉出，在背面膀胱三角区找出输尿管入口，分离双侧输尿管，插入细导尿管，记录每分钟尿液的滴数。 6. 打开二道生理记录仪，用压力定标装置对血压进行定标，稳定 5 分钟后，观察放血前动物的一般状态及血压、呼吸、中心静脉压、尿量的变化。 7. 打开颈总动脉套管的放血端，并与 50ml 注射器相连，使血液自颈总动脉流入注射器内，一直放血至血压 40mmHg 时，调节注射器内放出的血量，使血压稳定在此水平（图 7-4-1 ） 图 7-4-1 兔出血性休克示意图 8. 维持血压 40mmHg 20 分钟，观察注射器内血量的变化，记录失血期的各项生理指标（同步骤 6 ）。 9. 停止放血，倒掉输液瓶中剩余的生理盐水，将注射器内的血液加入到输液瓶中，快速从静脉输回放出的血液和生理盐水，进行抢救，输血输液总量为 3 倍失血量，速度为 150 滴 /min 。 10. 输完血液及生理盐水后，观察动物一般状态及各项生理指标，评价抢救效果。 11. 若实验中实验小组较多，输液治疗组还可分为：与失血量等量的生理盐水 + 失血全血 + 去甲肾上腺素 0.75mg/kg.bw ， 2 倍失血量生理盐水 + 失血全血 +654-2 1mg/kg.bw 及失血全血治疗组。 【注意事项】 1. 本实验手术较多，要减少手术性出血。对部分项目（如输尿管插管），手术可少做或不做，以确保实验的成功。 2. 各导管和注射器要肝素化并注意导管畅通，随时缓慢推注，以防凝血。 3. 插动脉插管前必须先向动物体内注射肝素，否则会造成插管内凝血，影响实验。 4. 插静脉插管时要小心，防止插管穿破静脉壁进入胸腔或其他软组织。 5. 若做输尿管插管，输尿管插入后切忌扭曲和折叠，正常情况下，导管插入即有尿液滴出；如果导管通畅但无尿液滴出，可少量快速输液。 【附录】 （一）复制失血性休克的 Lamson 氏法 本方法主要使用自动调节血压装置将血压控制在较低水平，既可消除动物失血后血压的代偿波动，又可减轻实验的工作量，因此，广泛应用在失血性休克的动物实验中。其具体方法是： 1. 取 250ml 输液瓶，加入 100ml 生理盐水后，经三通管与动脉套管及颈动脉相连（动脉套管的另一端与记录仪相连记录血压）。 2. 将输液瓶悬挂在高于心脏 50cm 以上的位置，打开三通管放血，血液流入瓶内，待血压降至预定水平后，通过维持储血瓶悬挂高度，使血压维持在预期水平。 3. 在实验中，如血压过低，则储血瓶内血液自动回输动物体内，使血压回升，若血压超过预定水平，则血液流入储血瓶，藉此将血压维持在预定水平。 4. 低血压稳定时间以实验要求而定，一般控制在 2060 分钟，该方法应使用肝素抗凝。 （二）肠系膜微循环观察方法 1. 动物称重麻醉后，仰卧位固定于手术台上。剪去左腹部毛，在左腹直肌旁做 5cm 纵行腹部切口，钝性分离肌肉，打开腹腔，推开大网膜找出一段游离度较大的小肠肠袢，轻轻从腹腔拉出，放置在微循环显微镜下的观察窗内进行观察。 2. 打开蠕动泵，以台式液 37 恒温灌流，灌流速度为 2030 滴 /min ，在微循环显微镜下找出具有丰富微动脉和微静脉的视野进行观察。 3. 肠系膜微循环观察时，需观察的主要指标包括微血管形态、数目、口径、微血流流速、血细胞聚集及微血管出血，通过这些指标的综合分析来评价微循环障碍程度。 【讨论思考题】 1. 为什么在抢救失血性休克时其输液总量要明显多于失血量？ 2. 在放血后维持务压时，为什么血压会出现明显波动？ 3. 在失血性休克抢救中有部分动物死亡或抢救效果较差，为什么？ 4. 本实验中各管道内最易发生凝血，当出现以上情况后应如何处理？ （刘艳凯 张学锋） 实验五 急性心肌缺血 / 再灌注损伤 【实验目的】 1. 学习用冠脉结扎的方法来复制家兔心肌缺血性损伤的动物模型。 2. 观察心肌缺血 / 再灌注损伤时机能、代谢及结构的变化规律，探讨其病因和发病机制。 【实验原理】 采用开胸术及冠脉结扎术复制家兔急性心肌缺血 / 再灌注损伤模型，通过观察动物心电图等机能指标、心肌组织匀浆糖含量、丙二醛（ malondialdehyde ， MDA ）、超氧化物歧化酶（ superoside dismutase ， SOD ）以及心脏结构指标的变化，观察心肌缺血 / 再灌注损伤的机能、代谢及结构的变化规律，探讨缺血 / 再灌注损伤病因和发病机制。 【实验对象】 家兔 【仪器与药品】 心电示波记录仪（或心电图机及心电示波器），家兔用人工呼吸机，兔实验台，普通离心机，低温高速离心机， 722 型分光光度计，婴儿秤、扭力天平，组织匀浆器，恒温水浴槽，动物手术器械一套，恒温水槽，微量加样器，生化操作玻璃器材一套。 20% 乌拉坦溶液， 80% 苯酚溶液，糖标准贮存液，糖标准应用液，生理盐水，浓硫酸，无水乙醇，蒸馏水。组织匀浆总蛋白、 MDA 、 SOD 测定试剂各一套。 【步骤和方法】 1. 正常家兔一般状态的观察与记录： （ 1 ）将动物称重， 20% 乌拉坦溶液由耳缘静脉缓慢推注（ 5ml/kg.bw ），行全身麻醉。当家兔进入初期麻醉时，将家兔仰卧位固定在手术台上，麻醉逐渐加深，保持安静状态。 （ 2 ）首先记录家兔呼吸频率，呼吸深度，估计家兔潮气量（一般在 20ml 左右），为人工呼吸做好准备。 （ 3 ）将心电图机各导联电极连接在家兔肢体上，即右上肢（红色标记电极），左上肢（黄色）、左下肢（兰色），右下肢（黑色）及胸前（白色），描记正常家兔心电图。心电图描记必须记录标准电压（ lmV ）曲线，以此计算各波电压，心电机走纸采用 25mm/s 速度。 2. 家兔气管插管术与人工呼吸： 家兔纵隔障与胸膜腔彼此分离，如果谨慎从事开胸术可避免气胸和肺萎陷。为保证实验成功，采用人工呼吸机正压呼吸控制动物呼吸，即人工呼吸。人工呼吸机的运转必须保证与动物自然呼吸相同步。潮气量不能过大造成肺过度膨胀，也不能过小造成肺不张，影响呼吸气量。为确保人工呼吸的正常进行，避免因气胸造成全身性缺氧，故实行气管插管术。 （ 1 ）用大弯剪刀沿家兔胸前部和颈部正中线剪毛，为手术做准备。 （ 2 ）沿家兔颈中线，上自甲状软骨向下至胸骨剑突处切开皮肤，逐层分离颈前部肌肉，暴露出气管将气管下穿一粗结扎线以备用。 （ 3 ）在游离段气管的气管软骨间用手术刀横切开气管的一半，行 “ ” 形切口，插入气管插管并结扎固定。插管通过胶管与人工呼吸机相连。开动人工呼吸机，调整呼吸频率，选定潮气量。在本实验的全过程中呼吸机不能间断。 3. 心肌缺血性损伤模型的制备： （ 1 ）开胸术： 切开家兔胸部皮肤，可见肌肉及突出的胸骨。家兔胸骨实际上是左右侧肋骨在中线处结合起来的一条骨性脊状隆起，依此作为正中线的标志。在距正中线左缘 2mm 处，上 2 肋下至剑突，切断肋骨，顺序是先将左侧胸肌的胸骨附着点切断，继之选择 3 、 4 、 5 肋骨附着点用手术刀刃向上至 2 肋，向下至 7 、 8 肋切断肋骨，扩大开胸切口，将切口用扩胸器扩开或用粗线缝于左右胸壁上向两侧拉开，即见心脏跳动，为结扎冠状动脉尚需剖开心包膜，方法是用小镊子将心包膜夹起再以小剪刀上至心房，下至心尖剪开心包膜。此时心表面清晰可见。 （ 2 ）冠状动脉结扎术： 家兔冠状动脉起始于主动脉根部动脉圆锥。分冠状动脉左、右旋支。左旋支沿左房、左室间沟从前向左右旋行，当行至距左旋支起始部 23mm 处分出前降支，它沿左、右室间沟下行。而左旋支继续旋行至左室前时向下分出左室支。该支粗大、膨起、自左旋支分出后即向后下方呈乙字形行走，先行至左室侧缘，再向后下方与大心脏静脉交叉并伴行，继续复返左缘，至左室前壁心尖区。左室支是冠脉左旋支的主要分支，上半段走行浅表，与大心脏静脉（ Great Cardiac Vein ）在上 1/3 段相距较远。其识别方法系按其动脉鲜红色（静脉呈紫红色）、突出于心肌表面、与心室收缩呈反向搏动，用指压法可证明血行方向流向心尖。一旦发生全身性缺氧该特征即消失。为了结扎左室支用一个中间挖空的药勺即掏心勺，从左室左缘向后伸进此勺，轻轻地将心脏托起向右上方翻动一个角度，仔细按解剖部位、左室支特征寻找辩认它（见图 7-5-1 ）。 当对左室支确认无疑时即用眼科小园针带细绦纶线于左室支管壁下穿结扎线，以备结扎。结扎点在左室支上 1/3 部位时，可导致左心室游离壁下 2/3 范围缺血。结扎法采用缝合结扎法及垫塞结扎法。 缝合扎结法：即选定在左室支上段不伴行静脉处，用持针器夹持小圆缝合针，由左室支左侧靠近血管壁刺入心肌，使针紧绕血管壁下方将结扎线由血管壁右侧穿出。不要刺破支脉造成出血，也不要距离血管太远造成不必要的心肌损伤。紧拉结扎线两端扎好第一次结，更不能松脱。结扎断血流时间在 40min 内，心肌损伤性变化是可逆性的。 垫塞结扎法：是为恢复血流实行再灌注设计的，它是在第一次结扎结内加一塑料套管和一个长约 23cm 、直径 1mm 的塑料绳。将塑料绳伸入空心管内并将此垫塞结扎在第一个结内，拉紧扎好第二次结。此结除达到结扎完全闭塞动脉外，当需要一定时间将结扎去除时只需拉出空心塑料管内塑料绳，再拔出塑料管，剪掉结扎线即可实行再灌注。 当结扎完毕后可迅速见到心室前壁、心尖区出现心肌颜色变化，先呈粉白色逐渐呈紫绀色，该区心肌收缩减弱。 图 7-5-1 家兔心脏冠状动脉左室支位置与结扎点 4. 观察心肌缺血性损伤的有关指标： 观察心肌缺血 / 再灌注损伤的机能、代谢及结构的变化规律，可选的指标很多，本实验设计的观察指标为： （ 1 ）机能指标： 以心电图描记记录与一般心功能观察为重点。家兔心电图在结扎后立即发生改变，是最敏感的指标，也是临床上诊断心肌梗塞的有力依据。表现为 R 波时期、 ST 段形态的变化。应用心电示波记录仪，或将心电图机与心电示波器连接起来，由示波器上观察心电波形，每隔 35min 记录一段心电图。由心电图上计算出心率， ST 段抬高了多少毫伏。注意观察再灌注家兔有无心律失常的发生。 （ 2 ）代谢指标： 心肌组织细胞不停进行代谢以产生供心肌收缩所需能量，当结扎左室支后，不仅缺少血氧供应，同时代谢产物也不易排出。这样，缺血区域内的代谢变化就很复杂。故选择心肌组织匀浆糖含量、 MDA 含量、 SOD 活性作为代谢指标进行观察。 （ 3 ）结构指标： 心脏剔出与缺血区检定是本实验的结构指标，并为心肌代谢指标取材之用。实验采用全心剔出的方法。用左手将家兔心脏抓起尽量提出胸腔，右手持剪刀在上、下腔静脉根部剪断，心脏即剔出。将心脏在冷生理盐水内洗一下，用 50ml 大注射器对准伸入主动脉，逆血流方向加压推注生理盐水冲洗心脏。当盐水沿冠状动脉将残血冲出后即见非缺血区呈现粉红色，而缺血区呈紫绀。缺血区范围的大小与结扎左室支部位的高低呈正相关系。本冲灌法使缺血区显而易见，行之有效。 5. 心肌组织匀浆制备： 各取实验模型新鲜的心肌缺血区与非缺血区（左室心底部）心肌组织 600mg 左右，在扭力天平上准确称量（称量过程中组织应保持冰浴）。按 1:9 的量加入冰生理盐水，置于小烧杯中，应用组织匀浆器匀浆。为防止研磨发热，匀浆过程中烧杯应浸在冰水中，研磨时间，不超于 2 分钟。所制备的匀浆浓度为 10% ，使用时可按倍数稀释。 6. 心肌组织糖含量测定： （ 1 ）原理：采用苯酚浓硫酸比色定糖法。本法灵敏，重复性好，简单易行，不受蛋白质干扰。其原理是还原糖在浓硫酸环境中与苯酚反应生成桔黄色化合物，在 490nm 处有强吸收峰。本法适用测单糖，也适用于直接测多糖，需水解。糖浓度在 5g50g 之间时光密度值为 0.051.0 之间，呈线性关系。 （ 2 ）主要试剂配制： 80% 苯酚溶液（ 80g 分析纯苯酚，加入重蒸馏水定容至 100ml ）； 浓硫酸（比重 1.84 ，含量 93% ）； 糖标准贮存液（精确称取 1.0g 分析标准糖，用 0.25% 苯乙酸定容至 100ml ）； 糖标准应用液（糖标准贮存液 1ml ，用重蒸馏水定容至 100ml ）。 （ 3 ）操作方法 心肌组织匀浆糖含量的测定：见表 7-5-1 。 葡萄糖含量标准曲线制作：见表 7-5-2 。 查标准曲线得出心肌组织匀浆糖含量（ mol/ml ），再计算出每克湿重心肌组织的糖含量。 表 7-5-1 心肌组织匀浆糖含量测定 试 剂（ ml ） 缺血区心肌匀浆 非缺血区心肌匀浆 待测样品（心肌匀浆） 0.2 0.2 重蒸馏水 1.8 1.8 苯酚液（ 80% ） 0.05 0.05 浓硫酸（冲入） 5.0 5.0 静置 10min ， 30 水浴 15min ，以蒸馏水调零， 490nm 波长测各测定样品的 OD 值。 表 7-5-2 葡萄糖含量标准曲线制作 试管号 试剂（ ml ） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 糖标准应用液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 重蒸馏水 2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 苯酚溶液（ 80 ） 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 浓硫酸（冲入） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 操作方法同上，绘成标准糖曲线（ OD 值为纵坐标，糖浓度为横坐标）。 7. 心肌组织匀浆 MDA 含量测定： 机体组织通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中多不和脂肪酸（ Polyunsaturated Fatty Acid ， PUFA ）引发脂质过氧化反应，其产物为 MDA ，测定 MDA 含量不仅可反映组织脂质过氧化的程度，也可间接反映细胞损伤的程度。 （ 1 ）原理： MDA 与硫代巴比妥酸结合，形成红色产物，在 532nm 处有最大吸收峰。 （ 2 ）试剂组成： 1 号试剂： 11ml 溶液，室温保存、天冷时会凝固，每次测试前适当加温以加速溶解，直至透明方可应用。 2 号试剂： 11ml 溶液，用时加双蒸水至 330ml 混匀。 3 号试剂：粉剂，用时加双蒸水至 110ml ，适当加温，充分溶解。 标准品： 10nmol/ml 四乙氧基丙烷 5ml 。 视测定样品的数量，配制甲、乙液。 甲液配制方法： 1 号试剂 :2 号试剂 :3 号试剂 =0.1ml:3ml:1ml 混合备用。 乙液配制方法： 1 号试剂 :2 号试剂 : 双蒸水 =0.1ml:3ml:1ml 混合备用。 （ 3 ）测试方法（见表 7-5-3 ）： 表 7-5-3 心肌组织匀浆 MDA 含量测定 试剂及样品（ ml ） 标准管 标准空白管 测定管 测定空白管 标准品 a* 测试样品 a* a* 无水乙醇 a* 甲液 4.1 4.1 乙液 4.1 4.1 旋涡混匀器混匀，置沸水浴 40min ，以 4000rpm/min 速度离心 10min ，吸取上清液，以蒸馏水调零、 1cm 比色杯在 532nm 处比色，读取各测定管及标准管吸光度。 测定心肌组织匀浆总蛋白含量（ /ml ）。 按下列公式计算结果： MDA （ nmol/ ） = 测定管吸光度测定空白管吸光度 10nmol/ml 蛋白含量 标准管吸光度 标准空白管吸光度 换算出每克湿重心肌组织的 MDA 含量。 （ 4 ）备注： a* 代表样品取样量和双蒸水取样