质粒DNA的酶切和连接.doc

华南师范大学实验报告学生姓名 闫红博 学 号 20122501108 专 业 生物科学 年级、班级 12级生科三班 课程名称 分子生物学实验实验项目：质粒DNA酶切、连接、电泳检测实验类型 验证设计综合 实验时间 2015年4月21日 实验指导老师 实验评分 1、 实验目的1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；2、了解影响酶切的因素；3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立；4、了解影响连接反应的因素。二、实验原理1、限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。 2、限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。 3、DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。4、 常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。三、实验试剂和材料1、材料与试剂酶切反应：标准pUC19(2686bp) EcoR及其配套的酶切缓冲液 检测：0.5TBE电泳缓冲液6电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖4、 实验步骤（1） 质粒DNA酶切在200l 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：l）混匀；点动离心将反应液甩至管底。37(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。反应结束后， 75，保温10min使酶失活。电泳检测 样品代号成份反应1（标准pUC19)无菌水(l)2P质粒(l)6H酶切缓冲液(l)1EEcoRI酶(l)1.0Total(10（2） 质粒DNA的连接取200 l的离心管按下表加入试剂。混匀后点动离心，将溶液甩至管底置于已调好温度为12-14PCR仪中保温1-2h后取出电泳检测样品代号成分用量（l）ddH2O7.0IDNA/EcoT14I片段10.0f连接缓冲液2.0TT4DNA连接酶1.0总体积205、 实验结果质粒DNA酶切实验结果图结果分析：从左向右，我的是第六条带，没有出现扩散情况。说明没有蛋白质与DNA结合，酶切条件也比较合适，没有外切核酸酶污染。质粒DNA连接酶实验结果图分析：从左向右，我的是第10个带。对照连接后的电泳图像，可以发现有连接不完整，还有少部分未能连接。6、 实验结果讨论1. 限制性核酸内切酶的酶切反应应属于微量操作技术，无论是DNA样品还是酶的用量都很少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系。2.注意酶切加样的次序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和DNA，最后加酶。前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从表面