（发酵工程专业论文）产角蛋白酶微生物菌株选育及产酶发酵条件研究.pdf

i j l 科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进行研究工 作所取得的成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均己在文中以明确方 式标明 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包含任何其他个人或集体己经发 表或撰写过的作品或成果 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 象 o l o 年 月1 日 臌名 盘q w 口年亨月刃日 i j l 科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本 人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 口保密 在一年解密后适用本授权书 本学位论文属于 叼 不保密 请在以上方框内打 4 学位论文作者签名 张午 y d 年 月1 日 胳名 赵 唧 夕i f 专月彩日 摘 要 摘要 我国每年产生大量的家禽羽毛和废次羊毛 家禽羽毛和废次羊毛的主要成分是 角蛋白 由于角蛋白含有大量的二硫键 氢键和疏水作用的存在 不容易被普通蛋 白酶水解 因而大部分未被利用 有的甚至造成环境污染 许多微生物能产生角蛋 白酶 角蛋白酶可将家禽羽毛 废次羊毛降解转变为可溶蛋白质 多肽或者氨基酸 用作动物饲料 变废为宝 减少环境污染 角蛋白酶还可用于羊毛表面的整理改性 提高羊毛品质 本课题以羊毛角蛋白为底物进行了产角蛋白酶微生物菌株选育及产 酶发酵条件研究 本课题以羊毛为唯一碳 氮源 从不同来源的7 个土壤样品中筛选得到5 0 株微 生物菌株 经初步鉴定其中3 2 株为放线菌 1 8 株为细菌 再经摇瓶复筛得到一株产 角蛋白酶活较高的细菌菌株f y m 6 0 1 其酶活为1 0 1 u m l 由于筛选的野生f y m 6 0 1 产角蛋酶活低 达不到工业生产的要求 为了提高 f y m 6 0 1 的酶活 采用紫外和微波2 种物理诱变手段进行了诱变育种 紫外诱变效 果优于微波诱变 经紫外诱变处理 筛选出了一株 u v 0 9 菌株 其酶活和发酵液中 可溶性蛋白含量为2 6 o u m l 和0 2 1 7 m g m l 分别是原始菌株的2 6 倍 2 4 倍 微 波诱变处理 菌株m w 1 产酶活力最高 其酶活1 4 8 u m l 约为原始菌株1 5 倍 因 此选择u v 0 9 菌株做进一步研究 培养条件及培养基成分对菌 体生长及产酶有很大影响 本课题研究了培养条件 及培养基成分对u v 0 9 菌株发酵产酶及降解羊毛的影响 实验结果表明 最适培养 条件为 1 羊毛 温度3 7 p h 值为9 0 接种量1 0 摇床转速1 8 0 r m i n 发酵 7 2 h 其产角蛋酶活达到了4 2 3 u m l 发酵液中可溶性蛋白含量达o 6 1 6 m g m l 外加碳 氮源和金属离子对u v 0 9 菌株发酵产酶有较大影响 2 葡萄糖 2 蔗 糖 2 可溶性淀粉均可促进产酶 其中葡萄糖促进产酶效果最明显 u v 0 9 酶活最 达4 9 u m l 然而乳糖的添加反而抑制了产酶 在所试验的4 种无机氮源中 n h 4 2 c 0 3 o 1 抑制作用最大 酶活仅为对照的4 0 实验添加的4 种有机氮源中 0 1 酪蛋白对产酶具有极大的促进作用 酶活高达7 7 u m l 提高了约7 0 然而 0 1 牛肉膏对产酶具强烈的抑制作用 研究还发现添加m n 2 有明显促进作用 而m 9 2 十 c a 2 却抑制作用显著 使产酶活力降低了约2 5 关键词 羊毛角蛋白 角蛋白酶 可溶性蛋白 筛选 物理诱变 发酵 河 i i 干 t j 支人学颂卜 文论文 a bs t r a c t a l a r g en u m b e ro fp o u l t r yf e a t h e r sa n dw o o lw a s t e sw e r ep r o d u c e d inc h i n ae a c h y e a r t h em a i nc o m p o n e n t so fp o u l t r yf e a t h e r sa n dw o o lw a s t e sa r ek e r a t i n k e r a t i ni s r e s i s t a n tt od e g r a d a t i o nb yc o m m o np r o t e a s e ss u c ha st r y p s i n p e p s i na n dp a p a i nd u et oi t s h i g hd e g r e eo f d i s u l f i d eb r i d g e s h y d r o g e nb o n d sa n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n s s om o s t o ft h e mh a v en o tb e e nu t i l i z e d e v e ns o m eh a sc a u s e de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n m a n y k i n d so fm i c r o o r g a n i s ma r ea b l et op r o d u c ek e r a t i n a s e f e a t h e r sa n dw o o lw a s t ek e r a t i n c o u l db ed e g r a d a t e di n t os o l u b l ep r o t e i n p e p t i d eo ra m i n oa c i db yk e r a t i n a s e t u r n i n g w a s t ek e r a t i n si n t ot r e a s u r ea n dr e d u c i n gp o l l u t i o n k e r a t i n a s ea l s oc o u l db eu s e dt o m o d i f yw o o ls u r f a c e i nt h i ss t u d y s c r e e n i n go fk e r a t i n a s ep r o d u c e ds t r a i n s a n d f e r m e n t a t i o nc 西n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e du s i n gw o o lk e r a t i na ss u b s t r a t e i nt h i sw o r k 5 0m i c r o o r g a n i s m ss t r a i n s w h i c hw e r ea b l et og r o wo nw o o la st h es o l e c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e w e r es c r e e n e df r o m7s o i ls a m p l e so fd i f f e r e n ts o u r c e s a f t e r t h ei n i t i a li d e n t i f i c a t i o no fm o r p h o l o g yo fc o l o n ya n dm y c e l i d i u m 3 2o f5 0s t r a i n sw e r e a c t i n o m y c e t ea n d18o f 5 0s t r a i n sw e r eb a c t e r i a ab a c t e r i as t r a i nf y m 6 0 1w h i c hh a dt h e m a x i m a lk e r a t i n a s ea c t i v i t yw a sg o t t e nf r o mf i r s t s c r e e n e d 5 0s t r a i n sb ys h a k e f l a s k r e s c r e e n i n g i t sa b i l i t yo fd e g r a d i n gw o o lw a sh i g h e r a n di t sk e r a t i n a s ea c t i v i t yw a s 1 0 1 u m l s i n c ek e r a t i n a s ea c t i v i t yo ff y m 6 0 1w a sl o w w h i c hd i dn o tm e e tr e q u i r e m e n t so f i n d u s t r y u l t r a v i o l e tm u t a t i o na n dm i c r o w a v em u t a t i o nw e r eu s e dt oi m p r o v ek e r a t i n a s e a c t i v i t yo ff y m 6 01 c o m p a r i n gw i t hu vi r r a d i a t i o nm u t a t i o n i m p r o v e m e n tw i t h m i c r o w a v em u t a t i o nw a sp o o r e r t h ek e r a t i n a s ea c t i v i t yw a s1 5t i m e sa sm a n ya st h e p a r e n ts t r a i n as t r a i nu v 0 9w a s s c r e e n e db yu vi r r a d i a t i o nm u t a t i o n w h o s ek e r a t i n a s e a c t i v i t yw a s2 6 0 u m la n ds o l u b l ep r o t e i nw a s0 217 m g m l w a s2 6a n d2 4t i m e sa s m a n ya st h ep a r e n ts t r a i nr e s p e c t i v l y c u l t u r ec o n d i t i o n sa n dm e d i u mc o m p o s i t i o nh a ds i g n i f i c a n te f f e c t so nc e l l sg r o w t h a n dp r o d u c t i n gk e r a t i n a s e i nt h es t u d y t h ee f f e c t so fc u l t u r ec o n d i t i o n sa n dm e d i u m c o m p o s i t i o no nk e r a t i n a s ep r o d u c t i o no fu v 0 9w e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc u l t u r e c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w w o o lc o n c e n t r a t i o n1 t e m p e r a t u r e3 7 2 p h9 0 i n o c u l u m l 0 r o t a t i n gr a t e1 8 0r m i na n df e r m e n t a t i o nt i m e7 2h o u r s t h ek e r a t i n a s e a c t i v i t ya n ds o l u b l ep r o t e i n w e r e4 2 3 u m la n d0 6 16m g m lr e s p e c t i v l y i nt h es t u d y i tf o u n dt h a ta d d i n gc a r b o n n i t r o g e na n dm e t a li o n sh a ds i g n i f i c a n t i i a b s t r a c t e f f e c t so nk e r a t i n a s ep r d u c t i o no fu v 0 9 k e r a t i n a s ea c t i v i t yw a si m p r o v e db ya d d i n g g l u c o s e 2 s o l u b l es t a r c h 2 a n ds u c r o s e 2 b u tl a c t o s eh a di n h i b i t i o no n k e r a t i n a s e a c t i v i t y t h em a x i m a lk e r a t i n a s ea c t i v i t y 4 9 u m l w a sg o t t e n w i t h g l u c o s e 2 f o u rk i n d so fi n o r g a n i cn i t r o g e ns o u r c e sw e r et e s t e d i n h i b i t i o no f n h 4 2 c 0 3a d d e do nk e r a t i n a s ep r o d u c e dnw a ss i g n i f i c a n t w h o s ek e r a t i n a s ea c t i v i t yw a s o n l y4 0 o ft h ec o n t r 0 1 a m o n gf o u ro r g a n icn i t r o g e ns o u r c e s 0 1 c a s e i nc o u l d i n t e n s i v e l ys t i m u l a t et h ek e r a t i n a s ea c t i v i t y a c h i e v i n g7 7 u m la n di n c r e a s i n gb ya b o u t 7 0 b u tk e r a t i n a s ep r o d u c e dw a si n h i b i t e dl a r g e l yb y0 1 b e e fe x t r a c t i nt h es t u d y i t a l s of o u n dt h a tk e r a t i n a s ep r o d u c e dw a ss t i m u l a t e db ym n 2 w h i l em 9 2 c 2 i n h i b i t e d s i g n i f i c a n t l ya n dr e d u c e dk e r a t i n a s ep r o d u c e da c t i v i t yb ya b o u t2 5 k e yw o r d s w o o lk e r a t i n k e r a t i n a s e s o l u b l ep r o t e i n p h y s i c sm u t a t i o nf e r m e n t a t i o n i i i 河 i k f f t 技人学硕十学丈沦文 目录 摘要 i a b s t r a c t i i 目录 i v 第1 章绪论 1 1 1 角蛋白 1 1 1 1 角蛋白定义 1 1 1 2 角蛋白分类 1 1 1 3 角蛋白结构 1 1 1 5 角蛋白利用 3 1 2 角蛋白酶 5 1 2 1角蛋白酶定义 5 1 2 2 角蛋白酶的分类 5 1 2 3 角蛋白酶的性质 5 1 2 4 角蛋白的酶解机理 6 1 2 5 产角蛋白酶微生物 7 1 2 6 产角蛋白酶微生物的诱变育种 9 1 2 7 角蛋白酶发酵条件研究现状 1 0 1 2 8角蛋白酶活力定义及测定方法研究 1 1 1 2 9 角蛋白酶的应用 1 2 1 3 课题研究目的与意义 1 4 1 4 主要研究内容 1 4 第2 章产角蛋白酶微生物菌株的土壤筛选 1 5 2 1 材料与方法 15 2 1 1 材料 1 5 2 1 2 培养基 16 2 1 3 实验方法 16 2 1 4 分析方法 17 2 2 结果与分析 18 2 2 1初筛 18 2 2 2 菌落形态观察 2 0 2 2 3 菌种保藏 2 1 口录 2 2 4 复筛 2 1 2 3 本章小结 2 6 第3 章产角蛋白酶菌株f y m 6 0 1 的诱变育种 2 7 3 1 材料与方法 2 7 3 1 1 实验材料 2 7 3 1 2 培养基 2 8 3 1 3 实验方法 2 8 3 1 4 分析方法 2 9 3 2 结果与讨论 3 0 3 2 1 紫外诱变 3 0 3 2 2 微波诱变 3 4 3 2 3 突变株遗传稳定性研究 3 6 3 3 本章小结 3 7 第4 章u v 0 9 菌株发酵产角蛋白酶条件研究 3 8 4 1 材料和方法 3 8 4 1 1 材料 3 8 4 1 2 培养基 3 9 4 1 3 分析方法 3 9 4 2 实验方法 3 9 4 2 1 u v 0 9 菌株生长曲线的测定 3 9 4 2 2 羊毛底物含量的影响 4 0 4 2 3 培养条件研究 4 0 4 2 4 培养基成分研究 4 0 4 3 结果与分析 4 1 4 3 1 菌株u v 0 9 生长曲线的测定 4 1 4 3 2 羊毛底物含量对产酶的影响 4 1 4 3 3 培养条件研究 4 2 4 3 4 培养基成分研究 4 5 4 4 本章小结 4 8 结论 5 0 参考文献 51 攻读硕士学位期间发表的论文 5 6 致谢 5 7 v 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1角蛋白 1 1 1角蛋白定义 角蛋白 k e r a t i n 为硬蛋白之一 是一类具有结缔组织和保护功能的纤维 状蛋白质 广泛存在于自然界中 以动物的毛 蹄和羽毛为主要存在形式f 1 1 2 角蛋白分类 根据角蛋白的空间结构可分为0 角蛋白和d 角蛋白 c 角蛋白由一螺旋构象的多肽链构成 三股右手q 螺旋向左缠绕 拧成一根称 为原纤锥的结构 直径为2 n m 原纤维再排列成 9 2 的电缆式结构 即微纤维 直 径为8 n m 成百根微纤维包埋在硫含量很高的无定形基质中 结合成一不规则的纤 维束 称大纤维 其直径为2 0 0 r i m 具有很好的伸缩性能 如乳哺动物的角蛋白 具有很好的伸缩性能 2 如毛发 羊毛 羽毛 羽茎 指甲 蹄 角等 p 角蛋白 是反平行式p 折叠片以平行的方式堆积成的多层结构 链间主要以 氢键连接 层间主要靠范德华力维系 因此它的特性为抗张强度高 但不能拉仲 2 1 如鸟类的角蛋白i 蚕丝和蜘蛛丝中的丝心蛋白 3 1 根据角蛋白存在的生物物种可分为哺乳动物角蛋白 鸟类角蛋白 爬虫类角蛋 白 3 1 目前可工业利用的角蛋白多为羊毛 羽毛的废弃物 1 1 3角蛋白结构 角蛋白的结构因种类不同有较大的不同 羊毛是a 螺旋结构角蛋白 图1 1 按其性质分为三个组织层次 即包覆在纤维外部的鳞片层 羊毛的主干一皮质层 处于纤维中心因富含空气而使羊毛纤维不透明的髓质层 其中 髓质层只存在于较 粗的羊毛中 有的呈连续状 有的呈断续状 细羊毛则无髓质层f4 1 因此羊毛主要 由鳞片层和皮质层两部分组成 羊毛的毡缩主要是由于羊毛具有鳞片层而带来的定 向摩擦效应 鳞片层是由片状鳞片细胞组成 分别是鳞片表层 鳞片外层 鳞片内 层 羊毛形态结构如图1 2 所示 鳞片表层 主要为磷脂化合物 角质化蛋白质及少量的碳水化合物 具有极 好的化学惰性 因此难以被酶消化 鳞片外层 最的典型角质化蛋白 胱氨酸残基含量很高 是羊毛中含硫最高 的部分 更难以被酶消化 1 河北科技人学硕十 孚 文论艾 鳞片内层 非角质化蛋白 胱氨酸残基含董 低 约为3 但是极性基团比 如 c o o h n h 2 含量相当丰富 化学性质活泼 易于膨化 能被蛋白酶消化 鳞片 结构如图1 3 所示 六埒堠 击 图1 1a 角蛋白形态结构 f i g i i s t r u c t u r eo fa k e r a t i n 图1 2 羊毛纤维形态结构 f i g 1 2 s t r u c t u r eo fw o o lf i b r e 2 囊度量 囊 靳 阁 反 第1 节绪论 c c m c 图1 3羊毛鳞片形态结构 f i g 卜3 s t r u c t u r eo fw o o ls q u a m a 1 1 5 角蛋白利用 角蛋白资源中羽毛及废次羊毛占比重最大 我国是世界上第二大羊毛生产 国 近年来 羊毛产量不断增长 但是沈毛 毛纺工序的羊毛利用率仅有3 0 全国每年将产生约5 0 力 t 的废次羊毛 7 1 废次羊毛的利用价值目i i f 很低 如毛纺 厂的废次羊毛经过开松 粗梳 纺纱 然后在织机上织造斜纹织物 8 这些仅 是物理机械手段的加工回收利用 其附加值很低 不能充分利用废次羊毛资源 羊毛角蛋白质成分含量高达8 0 以上i9 1 分布在羊毛鳞片表外层和原纤维中 纯度相对很高 是实用价值较高的角蛋白资源 1 1 5 1 氨基酸提取 羊毛角蛋白完全水解可得到18 种天然氨基酸 见表1 1 6 1 其中谷氨酸和胱 氨酸含量均超过1 0 羊毛中含有丰富的胱氨酸 谷氨酸天冬氨酸等氨基酸营养成分 目前 废 羊毛通过酸水解法或者碱水解法取胱氨酸等氨基酸 旧 酸碱水解法都是传统的 方法 投入大 对于设备要求高 反应剧烈 氨基酸的破坏程度较高 提取后 的废液酸碱度依然很高 会严重污染环境 微生物发酵降解羊毛角蛋白 将角蛋白降解为可溶性蛋白 提取氨基酸 污染少 也克服了对设备要求高的缺点 1 1 5 2 生物医学材料 羊毛角蛋白具有可作为生物医用材料的潜能 早在1 9 31 年 就有研究报道 了羊毛降解溶液与金属离子反应生成的复合物有杀菌抗感染的功效 川 培养细胞 19 9 8 年有研究者利用羊毛角蛋白培养l 9 2 9 细胞 初步显示羊毛角蛋白的生 物相容性 12 1 3 1 l j 北科技人学颐十学文论文 功能性纤维 一 鄂尔多斯羊绒集团提出 生角蛋白功能纤维加工技术 并且在纺丝溶液中 添加功能性分散液 使纺出的丝具有抗菌防静电功能ib 角蛋白膜和微胶囊 2 0 0 4 年t a n a b e 等在角蛋白浴液中 加入壳聚糖制得复合膜 1 4 还可以将角 蛋白溶液或者粉术直接放在热的压板上 高温高压环境下压制成角蛋白膜 1 5 1 9 9 7 年y a m a u c h i 等采用凝聚法制得角蛋白为囊膜的微胶囊 l 引 复合氨基酸溶液可以直接注入人体补充营养 替代部分人血浆 而胱氨酸 有护肝作用 可以有效防止脂肪肝 肝硬化以及其他肝病 在治疗脱发等方面 也有显著疗效 表1 1 羊毛中氨基酸含量 t a b 1 1 a m i n oa c i d si nw o o l 1 1 5 3 饲料和添加剂 实际中 不少饲料生产厂家将废次羊毛除杂后直接经高温膨化 再机械粉 碎作为饲料添加剂添加到动物或者家禽饲料中 采用生物法降解成可溶性蛋白 作为饲料添加剂 其中含有的氨基酸或者多肽物质可直接被家禽 动物消化 提高了消化率 提高饲料的应用价值 1 1 5 4 化妆品及其他行业 近年来 同本 美国等发达国家将角蛋白的水解液用作一类新型的天然化 妆品原料 成功用于沈发 护发 防晒和护肤等化妆品的生产 利用角蛋白降 解产物也可以用其生产液体氨基酸复合微肥 微生物降解角蛋白 不断释放氮 元素 为作物生长提供养分 4 第1 章绪论 1 2角蛋白酶 1 2 1角蛋白酶定义 具有降解角蛋白活性的酶叫角蛋白酶 k e r a t i n a s e l 角蛋白酶能特异性 的水解角蛋白 其中含有二硫键还原酶和多肤水解酶 二硫键还原酶首先作用 于角蛋白分子结构中的二硫键 使角蛋白高级结构解体 形成变性角蛋白 其 次 多肽水解酶作用将变性角蛋白逐渐水解成多肽 寡肽或游离氨基酸 角 蛋白酶主要来自自然界中能够降解角蛋白的微生物 需要有外源诱导物的诱导 而产生 是一类诱导型酶 1 9 1 2 2 角蛋白酶的分类 根据不同的分类标准 角蛋白酶的类型不同 根据微生物产角蛋白酶存在位置的不同可分为两类 一类是胞内酶 如鸡禽毛 癣菌酶 2 一类是胞外酶 如嗜热厌氧闪光杆菌酶 2 0 根据角蛋白酶作用的最适p h 值可将其分成三类 一类是酸性酶 最合适p h 值小于7 念珠菌产酶为酸性蛋白酶 2 1 一类是中性酶 如须癣毛癣菌酶 另一类为碱性酶 地衣芽孢杆菌酶等f 2 2 也可以 根据酶的组成成分为两类 一类是单体酶或寡聚酶 如念须癣毛癣菌酶和念珠菌酶 等 还有一类是复合酶 如链霉菌酶 23 1 据报道已分离纯化了许多微生物生产的角 蛋白酶 并对其特性进行深入的研究 目前 纯化的角蛋白酶以碱性丝氨酸型蛋白 酶为主 多数为胞外的单体酶或寡聚酶 由于分离提纯较困难 胞内酶研究得较少 1 2 3角蛋白酶的性质 1 2 3 1角蛋白酶的理化性质 角蛋白酶是由微生物在特定条件下产生的角蛋白水解酶 因此不同菌种来源的 角蛋白酶结构 活性 结合的底物特性以及酶的影响因素等也不尽相同 相对于其 他蛋白水解酶类 角蛋白酶具有与底物的结合更紧密 更适合的特点 这是该酶与 其他蛋白酶主要的区别所在 而且大多数角蛋白酶是诱导型酶 需要角蛋白外在的 诱导物的存在 羽毛 羽毛粉 毛发 角 角质层等角蛋白都可作为诱导物 它们 具有菌种专一性 随微生物的不同而表现出不同的物理参数 包括酶的稳定性 适 合的温度 p h 值和反应时间等 1 2 3 2 角蛋白酶底物的特异性 角蛋白酶对许多蛋白都有降解作用 包括可溶性和不可溶性蛋白 角蛋白酶可 以降解如酪蛋白 明胶 牛血清蛋白等可溶的蛋白质 不可溶的蛋白包括羽毛 羊 毛 人发 蚕丝 弹性蛋白 胶原蛋白 角质 鱼鳞 指甲和偶氮角蛋白等 24 1 另 外一些合成的底物也可以作为研究对象 s 河北科技火学硕士学文论文 i 2 3 3 角蛋白酶的稳定性 角蛋白酶活性受到温度 p h 值 各种离子和蛋白酶激活剂 抑制剂等多种因素 的影响 角蛋白酶最适的反应温度主要集中在3 0 一6 0 c 如某种弧菌产角蛋白酶最适 温度是3 0 c 25 1 念珠菌所产酸性蛋白酶最适温度为3 7o c t 2 6 1 多数在4 0 c 4 5 c 之间 27 1 但也有最适温度相对较高的 如纯白高温放线菌酶的最适活性温度达至l j 7 0 c 2 引 而嗜热厌氧菌a w 1 所产膜结合角蛋白酶的最适温度高达1 0 0 c 22 1 同时 温度也是 酶保持活性的重要影响因素 地衣芽孢杆菌的角蛋白酶在室温2 5 3 0 下 4 d 后 丧失一半活性 保存在低温 4 c 和 2 0 环境下1 9 d 后 酶活性分别丧失了2 0 和7 酶活性丧失的主要原因是酶的自解作用 2 5 1 多数来自细菌 真菌和放线菌的角蛋白酶最适p h 值在7 o 1 0 0 之间 如纯白高 温放线菌 2 8 1 和热紫链霉菌 2 9 分别为8 6 和8 0 真菌主要产酸性蛋白酶 如白色念珠 菌所产角蛋白酶的最适p h 值为4 0 1 3 0 一 目前发现的角蛋白酶大多数为丝氨酸蛋白酶 易被苯甲基磺酰氟 p m s f 等抑 制剂所抑制 3 卜3 2 1 添加的碳源如葡萄糖和氮源如蛋白质 氯化铵也可导致角蛋白酶 活的降低 33 1 此外 有一些还原剂 如巯基乙醇 亚硫酸钠对角蛋白酶的活性也有 影响f 2 8 金属离子对角蛋白酶活性的影响各异 据研究报道 c a m 9 2 m n 2 对角蛋 酶活性有促进作用 3 4 1 1 2 4 角蛋白的酶解机理 微生物能够降解角蛋白的关键因素在于微生物能够合成产角蛋白酶 目前 普遍认为微生物酶解角蛋白的过程分为三个步骤 变性作用 水解作用以及转 氨基作用 2 4 1 变性作用 角蛋白含有大量的二硫键使其立体化学结构比较稳定 抗化学试剂和水解 酶作用 但是二硫键一旦遭到破坏 角蛋白就容易变性 失去疏水和抗酶解作 用的能力 微生物降解角蛋白的过程中产二硫键还原酶首先打开角蛋白中二硫 键 就像采用化学或物理手段一样使其变性 这是角蛋白酶降解角蛋白的关键 步骤 1 2 4 2 水解作用 二硫键还原酶的变性作用破坏了角蛋白固有的稳定结构 在多肽酶作用下 发生水解作用 变性后的角蛋白逐步被水解成多肽 寡肽和游离的氨基酸 1 2 4 3 转氨基作用 6 第1 章绪论 据研究 添加毛发的培养液中发现随着纯白高温放线菌的生长 角蛋白被 降解成为可溶性多肽和氨基酸 经脱氨基作用产生氨 使培养液p h 值升高 2 9 1 这是微生物以蛋白质为底物生长时一种典型的消耗氮源的方法 上述的理论和酶解过程表明 角蛋白被降解过程非常复杂 且目前理论研 究还不够深入和完善 关于角蛋白降解机制还需进一步研究 1 2 5 产角蛋白酶微生物 目自 j 已先后发现3 0 多种具有降解角蛋白能力的微生物 真菌 细菌 放线 菌都能够分泌角蛋白酶 1 2 5 1 真菌 真菌是最早发现能够降解角蛋白的微生物 l8 9 9 年w a r d 就发现马爪甲团囊 菌能分解角蛋白 35 1 真菌能够降解角蛋白 因此它们可能能够合成角蛋白酶 主要产角蛋白酶的真菌为皮肤真菌 如红色毛癣菌 t r u b o m 鸡禽毛癣菌 t g a l l i n a e 短帚菌 s c o p u l a r i o p s i sb r e v i c a u l i s 石膏样小孢子菌 m c r o s p o r u m g y p s e u m 犬小孢子菌 m a n i s 白色念珠菌 c a n i d aa l b i c a n s 和热带念珠菌 c 抑i c 口厶 等 3 6 2 0 0 1 年t a w f i k 等从污水污泥中分离到两种真菌 d e r m a t o p h y t e s o p r o p h y t e s 经研究发现能够降解人发 鸡毛和羊毛 37 1 2 0 0 5 年a n b u 等从禽类 养殖场土壤中分离出一株可以降解角蛋白的真菌 s c o p u l a r i o p s i sb r e v i c a u l i s 并且 具有较强的分解能力 3 8 7 霉菌中黄曲霉一直被认为是最有前景的产角蛋白酶微生物 但是由于可能 会产黄曲霉素而限制了发展 19 9 6 年s a n t o s 等发现一株烟曲霉 a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s 可以在羽毛角蛋白为唯一碳源和氮源的培养基上生长 39 1 谭盈盈等分 离到拟青霉f 1 和a 1 并对其产酶发酵条件进行了研究 1 9 2 0 0 1 年中国科学院曹军 等从土壤中分离到一株有效降解角蛋白的栖土曲霉 a s p e r g i l l u s t e rt e r r i c o l a l 并对 其进行u v 射线处理后研究了发酵条件的优化 使酶活力活力提高了8 0 4 0 1 v i g n a r d e t 等分离得到一株微孢长囊头孢霉菌 d o r o t o m y c e sm i c r o s p o r u s 能降解 人体角质层 不产毒素 还能降解指甲 蹄角 4 1 2 5 2 放线菌 产角蛋白酶的放线菌主要是链霉菌属 1 9 5 8 年n o v a l 和n i c k e r s o n 最先报道了 弗氏链霉菌 s t r e p t o m y c e sf r a d i a e 分解角蛋白的能力 将从土壤中分离得到的纯白高 温放线菌 t h e r m o a c t i n o m y c ec a n d i d u s 接种到羊毛为唯一碳源和氮源培养基 发现羊 毛底物能诱导角蛋白酶合成 初步探明了角蛋白降解的机理 并提出了角蛋白复合 酶学说 4 2 43 1 l g n a t o v a 等对纯白高温放线菌 t h e r m o a c t i n o m y c ec a n d i d u s 做了进一步 研究 从发酵液中纯化获得了一种单体角蛋白酶 并且提取来的角蛋白酶和杆菌发 7 河北科技人学硕十学文论文 酵提驭的蛋白酶相比具有更高的水解角蛋白活性 4 4 1 b o c k l e 等发现密旋链霉菌 勋 e p t o m y c e sp a c t u m 具有降解羽毛角蛋白的能力 并通过酩蛋白琼脂糖亲和层析色 谱 从发酵上清液中提纯得到一种丝氨酸蛋白酶 该蛋白酶优于多种商业蛋白酶 27 1 b r e s s o l l i e r 等分离纯化到一株微白黄链霉菌 s t r e p t o m y c e sa l b i s o f l a v u s 并从发酵液中 分离出了具有分解羽毛角蛋白能力的丝氨酸蛋白酶 45 1 s z a b o 等分离得到一株嗜热禾 生链霉菌 t h e r m o t o l e r a n ts t r e p t o m y c e sg r a m i n o 该菌株在4 0 时降解角蛋白 的效果较明显 4 6 1 等从南极土壤 a中cie分nt离s adriana得到两株纯白高温放线菌 t h e r m o a c t i n o m y c e sc a n d z d u s 月 v 够羊毛废弃物 47 l 1 2 5 3 细菌 可降解角蛋白的细菌发现的比较晚 目前己经筛选和分离到很多能降解角 蛋白的细菌 大多集中在芽抱杆菌属 4 引 研究最系统 最深入的是由19 9 0 年 w i l l i a m s 等分离的地衣芽孢杆菌 b a c i l l u sl i c h e n o 删括p w d 1 该菌能在以羽毛 为唯一有机底物的培养条件下生长 最适生长温度为4 5 5 0 该菌只能降 解经高温蒸煮的羽毛 而且所产角蛋白酶己被纯化 其角蛋白酶基因k e r a 也已被 克隆 并在多种宿主中表达成功 4 引 1 9 9 3 年a t a l o 等分离得到一株嗜热杆菌 b a c i l l u s s p p 0 0 1 a 该菌可以降解多种纤维性蛋白质 50 1 1 9 9 5 年胡介卿等从鸬鹚的肠道内分 离得到的f 5 变异枯草芽孢杆菌 b a c i l l u ss u b i l 西 具有极强的分解角蛋白的能力 5 1 1 1 9 9 6 年f r i e d r i c h 等分离得的一株利用羽毛角蛋白的嗜热厌氧闪光杆菌 f e r v i d o b a c t e r i u mi s l a n d i c u ma w 1 1 能分泌降解能力较强的胞外丝氨酸型蛋白酶 2 们 2 0 0 0 年s a n g a l i 等从厌氧消化系统中分离到一种中温细菌 属弧菌科 v i b r i o n a c e a e 2 5 3 0 下生长良好 在2 d 内可将未经蒸煮的羽毛几乎完全降解 具有t 发价值 2 5 1 2 0 0 1 年 r o z s 等又从部分降解的羽毛中分离出了一株具有降解角 蛋白能力的地衣芽孢杆菌 发酵温度4 7 p h 值为7 0 时该菌表现出极强的降解能 力 5 2 1 姚淑敏等从长期堆放羽毛的土壤中分离筛选到一株芽孢杆菌 测得发酵粗酶 液的最高酶活力为2 5 2 0 u m l 6 1 2 0 0 2 年n a m 等分离得到一株嗜热厌氧菌 f e r v i d o b a c t e r i u mi s l a n d i c u ma w 1 并纯化得到一种膜结合角蛋白酶 该酶的最适 温度高达1 0 0 2 引 g e s s e s s e 等又发现了两株细菌n e s t e r n k o n i as p 和b a c i l l u s p s e u d o f i t m u s 产碱性蛋白酶 5 3 2 0 0 6 年b e r n a l 等分离到一株能降解角蛋白的细菌 k o c u r i ar o s e a 5 4 综上所述 具有降解角蛋白能力的微生物种类繁多 反应了降解角蛋白的微生 物存在的广泛性和适应性 不同微生物降解角蛋白的种类各不相同 降解条件 降 解产物当然也各有差异 因此 所分泌的角蛋白酶酶学性质也不尽相同 8 第1 章绪论 1 2 6 产角蛋白酶微生物的诱变育种 微生物菌种产酶活力的高低是酶制剂生产的关键因素 羊毛是一种难以被生物 降解的蛋白质 以羊毛为底物筛选产角蛋白酶的研究报道很少 菌种都来自土壤筛 选 野生菌株产角蛋白酶活力较低 菌种产酶稳定性差易退化 产酶量低 产酶成 本高等 这些因素成了研究和大规模生产的主要制约因素 因此可以人为的采用物 理 化学诱变手段 进行诱变育种 得到产角蛋白酶活力高 产酶量大的菌株 以人工诱发基因突变为基础的诱变育种具有快速高效 方法简单等优点 是菌 种选育的一个重要途径 在发酵工业菌株选育中具有卓越的成就 诱变育种不仅可 以提高菌株的生产能力 而且还可以改进产品的质量 扩大品种 简化生产工艺 因此 该方法在科学实验和生产上得到了广泛的应用 诱变育种依据其所使用诱变 剂类别分为物理诱变 化学诱变和生物诱变 其中物理诱变是使用各种射线对微生 物进行辐射诱变操作 由于其效果好 而被广泛应用 1 2 6 1 紫外诱变 紫外线是位于可见光紫外光区以外 波长为1 3 6 3 9 0 n m 之间的不可见光 其生 物学效应 5 主要是使d n a 分子形成嘧啶二聚体 即两个相邻的嘧啶共价连接 二 聚体出现会减弱双键间氢键的作用 并引起双链结构扭曲变形 阻碍碱基间的正常 配对 从而可能引起突变 紫外诱变操作方便 设备成本低廉 诱变效果较好 在 微生物育种种己被广泛应用 1 2 6 2 微波诱变 微波辐射属于一种低能电磁辐射 具有较强生物效应的频率范围在3 0 0 m h z 3 0 0 g h z 对生物体具有热效应和非热效应 其热效应是指它能引起生物体局部温度 上升 从而引起生理生化反应 非热效应指在微波作用下 生物体会产生非温度关 联的各种生理生化反应 在这两种效应的综合作用下 生物体会产生一系列突变效 应 而微波对微生物的非热效应是微生物诱变育种的主导效应 非热效应f 5 6 可能源 于以下几个方面 微波是一种电磁波 其交变电场对微生物细胞内d n a 等极性分子的洛伦兹 力作用 强迫其按照电磁场作用的方式运动 从而引起d n a 分子点突变 产生遗产 变异 微波极强的穿透效应使胞内外水分子同时产生剧烈转动 从而引起细胞壁 通透性发生变化 促进细胞内代谢物分泌 2 4 5 0 m h z 微波能使水分子在1 s 内以1 8 0 0 回转动2 4 5 亿余次 强烈的转动 摩擦使得胞内d n a 分子氢键和碱基堆集力受损 最终引起d n a 分子结构变化导致 遗传变异 9 河北科技人学硕十学文论文 微波也被用于多个领域的诱变育种 如农作物育种 禽畜育种和工业微生物育 种 并取得一定成果 1 2 6 3 产角蛋白酶微生物菌株的诱变育种 关于产角蛋白酶微生物诱变育种的研究报道不多 蔡成刚利用羽毛为底物从土 壤中筛选出一株产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌 并利用c 0 6 射线物理诱变和n t g 化 学诱变两种方法得到了突变株k d n 2 酶活力较原菌株提高了1 5 倍 5 2 0 0 1 年 中 科院曹军采用紫外诱变方法对产角蛋白酶野生菌株栖土曲霉进行了诱变处理 使活 力提高了8 0 4 0 1 2 7 角蛋白酶发酵条件研究现状 利用角蛋白为底物发酵产角蛋酶的过程中 发酵条件会影响发酵产酶活力 发酵培养基的初始p h 值和培养温度是两个基本的影响因素 大多数微生物发酵 产角蛋白酶 初始p h 值多为6 l o 细菌产角蛋白酶研究中 w a n g 研究的 b 1 i c h e n i f o r m i sp w d 1 菌株在中性条件下产酶活力最佳 58 1 而k i m 等研究的 b a c i l l u sp u m i l i s 菌株在弱酸性条件下产酶活力最高 59 1 真菌产角蛋白酶研究中 s a n g a l i 等筛选的弧菌k r 2 和r i f f e l 6 0 筛选得到的c h r y s e o b a c t e r i u mk r 6 贝 0 表现出在 p h 值为5 o 8 0 的范围内都可以产角蛋白酶 而发酵温度一般控制在2 8 5 0 之间 少数嗜热微生物发酵温度控制在7 0 左右 在角蛋白酶的培养方式上 据报道 多数细菌类微生物为液体深层发酵 少数嗜热的细菌和真菌采静置培养的方式 6 1 6 2 1 2 0 0 6 年d e a z e r e d o 等在链霉菌 s t r e p t o m y c e ss p 5 弓4 产角蛋白酶研究中采用了固体发酵技术 6 3 1 液体静置培养和 固体发酵培养的微生物多数能直接利用和降解羊毛 羽毛等天然的角蛋质 2 8 液态深层发酵和静置培养方法需要将培养基高温灭菌后接种菌体再进行培养 以上的培养方法都为好氧条件下培养 w i l l i a m s 4 8 等报道了厌氧发酵生产角蛋 白酶和氨基酸的研究 角蛋白酶为诱导酶 多种微生物可以利用角蛋白为唯一碳 氮源产生角蛋 白酶 羽毛 羽毛粉 羊毛 角 毛发等角蛋白可以诱导微生物产酶 外加的 碳源和氮源对发酵产角蛋白酶会造成影响 大多数蛋白酶的发酵研究中 葡萄 糖对蛋白酶生产具有抑制作用 2 4 2 8 3 6 1 然而傅伟等在以羽毛为底物发酵产角 蛋白酶的研究中 葡萄糖对产酶有促进作用 6 4 1 多数研究中 某些有机氮源如 牛肉膏 蛋白胨等促进产酶 4 0 1 有些研究发现添加无机氮源如 n h 4 2 s 0 4 n a n 0 3 n h 4 n 0 3 n h 4 2 c 0 3 对产酶有抑制作用 6 4 1 而w i l l i a m s 等在 b 1 i c h e n i f o 册如p w d 1 发酵产酶条件研