MTT法与SRB法测IC50的比较.doc

方法 问题吸光度范围误差来源操作MTT法0-0.7MTT还原产物（甲瓒）需被DMSO充分溶解；96孔板靠近边缘的两轮易挥发，测定时间超过24h即舍去这两轮数据（可保证培养箱中一定的湿度）MTT过滤除菌、避光、不可反复冻融，致癌SRB法1.5-2.0非缓冲Tris-base碱液溶解与细胞蛋白结合的染料应迅速，避免动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附不容易变色，操作繁琐MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 调pH 7.4 定容1L注意事项MTT一般最好现用现配，过滤后4避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者可以把操作台上的照明灯关掉.做MTT测定中,觉得最容易引起误差的一个问题, 是96孔板里溶液在培养过程中容易挥发, 特别是靠近边缘的两轮,在测定时间超过24小时的情况下, 存在明显的挥发现象, 测定数据与中心孔有较大的出入. 所以做的时候要求培养箱里的湿度条件控制的比较好, 要不就需要弃取周围两轮孔的数据. 另外,有些时候在需要加入不溶性颗粒状药物的情况下测定细胞的增殖情况, MTT法就比传统计数法或台盼蓝法效果好, 测定速度快, 不容易引起误计.MTT的方法不够敏感，而且如果不是贴壁细胞的话，在离心后去除培养基是容易丢失细胞，造成孔间平行度比较差。3H-TdR的敏感度非常好，但是重复性不是特别好，孔间差距比较大，而且不同时间的重复试验时CPM值可以相差比较大。可以通过寻找比较好的细胞浓度，确定掺入时机（细胞处于对数生长期）和掺入时间来弥补。贴壁细胞1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2.、5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.、5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。另有说法强调加MTT时用无血清培养液（1 MSC 1105 ,100ul接种96孔板 2 测前4h，更换无血清培养液，同时加入20ul/孔 MTT液（5 mg/ml），37 0c，5%co2，4h 3 吸取上清，加入150 ul DMSO ，震荡15 min 4 37 0c，5%co2，4h（此时间应根据具体的颜色反映来定） 5 490 nm 测OD 值，）5、终止培养，小心吸去孔内培养液。6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1106/ml，按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 l g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物10ul；细胞悬液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100m(储存液100 1640）。2、置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔（1）SRB检测方法：磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，是一种检测细胞增殖情况的方法。（2）SRB检测方法的原理：SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在540 nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。SRB染色后不会像MTT法那样很容易变色，细胞固定染色后在96孔板中可以放置较长时间，因而受测定时间的影响较小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的96孔细胞培养板可在同一时间测定，测定的吸光值结果不会受到明显影响。吸光值与SRB浓度作图时，在OD单位1.52.0以下为线性，当超出线形范围时，最好稀释后重新读数。虽然SRB法比其他检测方法操作步骤繁琐，但是由于时间可以自己掌握，不受限制，因此适用于高通量筛选。（3）SRB检测的操作步骤：1)细胞固定：药物作用时间终点时，每孔加入50L4预冷的TCA溶液(30%，w/v)固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。2)染色：待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70L，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。3)检测：用100L非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值。操作中，应注意洗除染料时操作需迅速，避免用移液器吸取液体，防止动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附。（4）SRB检测的计算公式根据美国国立癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)关于SRB检测的介绍，细胞增殖百分率的计算存在以下两种情况：1)Tx-T00，PG=100(Tx-T0)/(C-