第六章、郭汝庆.doc

核酸分子探针的学习小结分子信标探针可形成发夹结构的寡核苷酸探针，5末端标记荧光素，3末端标记淬灭剂。自由状态时后，分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。近年来,分子信标因具有灵敏度高,特异结合性好等优点而被广泛应用于生物学和生物分析领域。在注重功能基因研究的后基因组时期,分子信标将会被更多地应用于基因突变引起的疾病的研究、活细胞中RNA 的检测、蛋白质的检测及生物芯片研究等。随着分子信标技术的发展和新型分子信标的不断出现,分子信标将会在基因诊断、基因治疗以及新药的研制开发等方面得到越来越广泛的应用。分子信标的组成十分的简单。分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有2535个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由1530个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由58个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5端；淬灭基团一般连接在3端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。具体的结构如下图所示：分子信标的工作主要依赖荧光基团与猝灭基团的相互的作用。自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与猝灭分子靠近(约为710nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。图2为分子信标的工作原理，当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大。根据Foerster 理论, 中心荧光能量转移效率与两者距离的6 次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。分子信标的正常的工作受许多因素的影响。分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度。有文献表明温度对分子信标探针的影响如下：在较低温度下，分子信标与靶标结合呈S1状态，发出荧光。随着温度升高，分子信标与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即S2状态，从而荧光强度减弱。温度持续增高，将导致分子信标熔链即S3状态，荧光基团与淬灭基团分离，导致荧光恢复。环境pH值也是影响分子信标的一个因素。pH值过高，分子信标的发卡结构可能被破坏，出现假阳性结果。此外，分子信标的纯度，也将对分子信标产生影响。分子信标的应用十分的广泛。下面以核酸的检测分析与研究DNA与蛋白质分子的相互的作用为例来说明:1、核酸的监测与分析。下面与常规核酸检测方法相比，分子信标用于核酸检测具有如下特点：a 可以进行液相杂交检测：常规核酸检测方法主要为固相杂交，要把未结合的探针和引物分离后才能利用其他信号对靶核酸进行检测；分子信标可以直接加入核酸扩增体系进行检测，检测方法可以直接在紫外灯下或借助荧光光谱仪进行定量检测。b 有效消除核酸交叉污染：利用分子信标可以直接对封闭微量离心管或多孔板中的核酸检测，完全避免核酸中间操作环节，彻底消除核酸交叉污染。c可进行核酸实时(real time)检测：在PCR 体系中加入分子信标,并把PCR 仪与荧光光谱仪相连,可以对PCR 反应过程随时进行监测。d 特异性强在对分子信标与靶序列杂交特异性研究中意外发现，与线性寡核苷酸探针相比，茎环状结构的分子信标检测特异性更高，对靶序列中单个碱基的错配、缺失或插入突变均能检测出来。e 灵敏度高：分子信标可以直接检测核酸；在应用过程中常与PCR 等核酸扩增技术联合应用，因而低至1拷贝的核酸也能检测，敏感性很高。f 可实现核酸大规模自动化检测：分子信标的最大优点是可以实现核酸的大规模自动化检测，分子信标在核酸检测应用中的例子充分证明了这一点。g 可对活体内核酸动态进行检测：目前尚缺乏有效方法对活体内核酸直接进行研究，分子信标技术为对活体内核酸代谢转移等动态过程研究提供了可能并已用实验证实。2、研究DNA与蛋白质分子的相互的作用。核酸和蛋白质这两种生物大分子之间的相互作用的研究是现代分子生物学、生物技术发展最快的领域之一。人们在研究核酸与蛋白质的相互作用上已经做大量的工作,也建立了大量的方法和技术。如:DNA 足迹法、交联技术、过滤结合技术、凝胶阻滞分析、亲和色谱、圆二色性光谱(CDS)、X 射线晶体衍射、荧光光谱分析等。这些方法和技术能够提供大量的分子间相互作用的信息,如:DNA结合位点、结合区的长度和特异性、蛋白质结合时对DNA 总的构象及位点结构的影响等。在这些方法中荧光分析的方法是一种较灵敏的方法,对于研究DNA 蛋白质的相互作用,可达到mmol 甚至更低的浓度。特别是,近年来利用荧光共振能量转移的原理设计的各类探针,用于分析DNA 蛋白质的相互作用取得了很大的进展。但到