纤维素酶最适反应温度的测定.doc

本科学生实验报告学号 104120434 姓名 穆志国 学院 生命科学学院 专业、班级 10生物技术 实验课程名称 纤维素酶最适反应温度的测定 指导教师及职称 李俊俊 开课时间 2012 至 2013 学年 下 学期填报时间 2013 年 4 月 17 日一、实验目的1、了解不同温度条件对酶活性的影响2、掌握酶最适反应温度的测定方法二、实验原理 温度对酶促反应速率的影响有两方面：一方面，温度升高可加快分子运动速率，提高分子碰撞概率，从而使反应速率加快；另一方面，温度升高可能使酶蛋白逐步变性而失活，从而降低酶促反应速率。温度对酶促反应速率的影响是这两方面作用的综合结果。所以只有在某一温度范围内时，酶促反应速率才会随着温度的升高而升高，达到最大反应速率时的温度称为酶作用的最适温度（Optimum Temperature）。 将其它条件（如酶浓度、底物浓度、pH、反应时间等）固定在最适状态，然后在一系列不同温度条件下进行酶活力测定。绘制得到温度酶活力曲线。 酶的最适温度并不是酶的特征常数，受其它因素的影响。3、 实验试剂1、柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L pH4.（适用于酸性纤维素酶）2、磷酸缓冲液， 0.1mol/L pH6.0（适用于中性纤维素酶）3、CMC-Na溶液（底物溶液，pH4.8和pH6.0 ）4、DNS试剂（CMCA-DNS）5、纤维素酶液（ pH4.8和pH6.0）4、 实验仪器 1、分光光度计 2、沸水浴 3、恒温水浴（1000.1） 4、分析天平（感量0.1mg） 5、移液器 6、计时器 7、磁力搅拌器5、 实验方法1、 本实验在室温至90之间选择不同温度测定酶活力，以找出纤维素酶在此条件下的最适温度。2、 待测酶液制备 称取固体纤维素酶1g，精确至0.1mg，用蒸馏水溶解，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差落在0.20.5范围内，不在此范围内，酶液要进行重新稀释），待测。3、测定步骤（1）取3支25mL刻度具塞试管（1支做空白管，2支做样品管）。（2）分别向3支管中准确加入用相应pH缓冲液配制的CMC-Na溶液2.00mL 注意：加入CMC-Na溶液时应缓慢，不可粘在试管壁上。（3）分别准确加入稀释好的待测酶液0.5mL于2支样品管中（空白管不加） 用涡旋混合器混匀。（ 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可顺 着试管壁加入）（4）将3支试管同时置于不同温度水浴中，准确计时，反应30min，取出。（5）迅速准确地向3支管中加入3mLDNA试剂（加液顺序和加酶液顺序相同以保证反应时间相同），振荡摇匀，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL，摇匀。将3支管同时放入沸水浴中，准确计时，煮沸10min取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。（6）以空白管调零，在分光光度计540nm波长下，用1cm比色皿，分别测量2支样品管中样液的吸光度OD值，分别记为ODE1、ODE2 ，取二者平均值。带入标准曲线方程计算酶活力。注意：不同温度指室温、30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 4、纤维素酶酶活力计算纤维素酶酶活力（U/g）=(K平均OD+b) N / 0.50.5式中： K标准曲线的斜率b标准曲线的截距N试样的总稀释倍数0.5反应酶液的体积，mL0.5反应时间，h酶活力的计算值保留3位有效数字注意：同一试样两个平行测定值的相对偏差在8%以内，二 者的平均值为最终的酶活力测定值。5、葡萄糖标准曲线图一:葡萄糖标准曲线（注：在前面的实验中已经测得，可以沿用前面中实验所得的结果）6、 实验结果（1）、实验所测得的数据温度（）平均OD值平均OD值（PH=4.8）平均OD值（PH=6.0）室温（约为26）0.22050.0685300.28450.2475400.28300.340500.38300.2205600.39550.189700.50250.145800.4390.089900.0820.049表一：在不同温度条件下，当PH值分别为4.8和6.0是测得的吸光度注：当温度为50和60时，使用的酶液稀释倍数为10000倍，而其它的温度时刻，稀释的倍数都是为5000倍（2） 、应用公式进行计算酶活，可以得到下表当Ph=4.8时 温度（）酶活（u/ml)室温（约为26）2025.12302834.08402815.12508158.24608474.24705589.6804786.9690274.48表二：PH=4.8时，不同温度下的酶活当PH=6.0时温度（）酶活（u/ml)室温（约为26）103.84302366.4403535.6504050.24603253.92701070.880362.9690-142.64表二：PH=6.0时，不同温度下的酶活为更直观的表示，纤维素酶在不同温度下的变化，做出如下散点图图二：不同温度下的酶活力的变化（3） 、实验结果分析、由图二可以看出，当PH为4.8时比PH=6.0时酶的活力更高，说明在偏酸性的时候，纤维素酶的活力更强；、由图二可以看出，随温度的变化，酶的活力呈正态分布，温度过低时酶的活力较低，而温度过高时酶的活力也会变低，甚至失活；、由图二可以看出，当PH=4.8时，温度为60时，为纤维素酶的最适酶活力温度；、由图二可以看出，当PH=6.0时，温度为50时，为纤维素酶的最适酶活力温度；（4） 、实验总结 通过本实验，在不同的温度条件下纤维素的酶活，让我们掌握了变温对酶活力的影响，同时也对温度对酶活力的影响有一个直观的了解。同时在实验中需要同