高中生物 第四章 生物化学与分子生物学技术实践 第10课时 分子生物学技术同步备课课件 苏教版选修1.ppt

第10课时分子生物学技术 第四章生物化学与分子生物学技术实践 学习导航1 结合教材了解pcr技术的基本操作 2 理解pcr扩增dna片段的原理 3 结合教材 尝试进行目的dna片段的体外扩增 重难点击1 了解pcr技术的基本操作 2 理解pcr的原理 一 使用pcr仪的安全措施和pcr反应程序 二 目的dna片段的体外扩增与鉴定 内容索引 当堂检测 一 使用pcr仪的安全措施和pcr反应程序 1 dna分子的结构 1 写出各个标号的名称 基础梳理 胞嘧啶 腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 脱氧核糖 磷酸基团 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 氢键 碱基对 一条脱氧核苷酸链 2 dna的两条链是反向平行的 为了明确表示dna链的方向 通常将dna的羟基末端称为3 端 将磷酸基团的末端称为5 端 按此原则在图上方框内标出两条链的方向 答案左链上5 端 下3 端 右链上3 端 下5 端 答案 2 细胞内dna复制条件分析 两 脱氧核苷酸 dna双螺旋 合成dna子链 atp 3 端 3 pcr技术 1 概念 在快速扩增的技术称为pcr技术 2 物质条件 3 pcr反应的过程及结果 pcr反应程序a 在94 高温下 作为模板的解旋成为 b 反应体系的温度降至 引物与作为模板的单链dna上的相互配对 体外 特定基因或dna序列 目的dna片段 dna模板 四种脱氧核苷酸 taqdna聚合酶 引物 变性 双链dna 单链dna 退火 复性 55 特定部位 c 反应体系的温度回升到 按照单链dna上的脱氧核苷酸序列 4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则 在taqdna聚合酶的作用下连接到引物之后 使引物链延伸 形成互补的 结果a pcr扩增一般要经历三十多次循环 每次循环都包括 三步 b 两引物之间的固定长度的dna序列呈扩增 延伸 72 左右 dna双链 变性 退火 延伸 指数 问题探究 1 pcr原理pcr反应与体内dna复制的引物在化学本质上是否相同 请分析原因 答案不相同 体内dna复制所需引物为rna聚合酶合成的一小段rna 但pcr反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链dna 答案 2 pcr反应过程 1 pcr反应中需要解旋酶和dna聚合酶吗 若需要 则与细胞内dna复制有何区别 答案pcr反应不需要解旋酶 但需要dna聚合酶 由于pcr反应中需要高温使dna解旋 因此pcr所需的dna聚合酶能耐高温 2 pcr的每次循环中应如何控制温度 请分析原因 答案每次循环中先高温解旋 再低温使引物与模板结合 最后适当升温有利于taqdna聚合酶发挥作用 答案 3 结合下图分析pcr过程中dna复制的方向是怎样的 答案 答案dna的羟基 oh 末端为3 端 磷酸基团的末端为5 端 当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后 dna聚合酶就能从引物的3 端开始延伸dna链 dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 pcr扩增与dna复制的异同 解析dna聚合酶不能从头开始合成dna 故dna复制需要引物 dna聚合酶只能从3 端延伸dna链 而不能从5 端延伸dna链 引物通过碱基互补配对原则与dna母链相结合 pcr扩增的对象是dna 不是氨基酸序列 拓展应用 1 下列关于dna复制和pcr技术的描述中 正确的是a dna聚合酶不能从头开始合成dna 只能从5 端延伸dna链b dna复制不需要引物c 引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合d pcr扩增的对象是氨基酸序列 答案 解析 解析pcr技术中用高温使dna分子中的氢键打开 从而解旋 其原理是dna的热变性原理 2 pcr技术有效地解决了因为样品中dna含量太低难以对样品进行研究的问题 而被广泛应用 与细胞内的dna复制相比 pcr可以快速扩增所需的dna片段 请分析回答下列有关问题 1 体内dna复制过程中用解旋酶打开双链dna 而pcr技术中的解旋原理是 答案 解析 dna的热变性原理 2 此过程需要一种taqdna聚合酶 该酶是从中分离的 解析taqdna聚合酶是从水生耐热细菌taq中提取的 3 与普通dna聚合酶相比 taqdna聚合酶具有的特性是 解析与普通dna聚合酶相比 taqdna聚合酶在90 以上的环境中不变性 具有耐高温的特性 4 与体内dna复制相比较 pcr反应要在中才能进行 并且要严格控制条件 解析pcr反应需要适宜的温度和ph 因此pcr反应要在一定的缓冲溶液中进行 并需严格控制好温度条件 答案 解析 水生耐热细菌taq 耐高温 一定的缓冲溶液 温度 5 pcr中加入的引物有种 加入引物的作用是 解析pcr需要两种引物 引物的识别位点决定了pcr扩增的dna片段 pcr中加入的引物一般是一小段单链dna 作用是引导dna复制 可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键 成为dna复制的起点 答案 解析 2 作为dna复制的起点 细胞内的dna复制需要适宜的温度和ph吗 若需要 是如何实现的 答案需要 细胞内的适宜温度和ph与内环境的稳态有关 低等生物与环境因素有关 答案 与pcr原理有关的三个易错点 1 酶的作用位点 解旋酶的作用是使dna两条链之间的氢键断开 dna聚合酶与dna连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键 不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键 2 dna聚合酶和dna连接酶 dna聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3 端上 需要模板 而dna连接酶连接的是两条dna片段的缺口 不需要模板 3 pcr中的解旋过程 pcr过程中不需要解旋酶 需要升高温度才能打开氢键 但此时的温度不会破坏磷酸二酯键 因此 dna加热变性后变为单链 并未分解成单体 二 目的dna片段的体外扩增与鉴定 基础梳理 1 dna片段的pcr扩增 1 准备器材 pcr仪 台式高速离心机 0 2mlpcr微量离心管 自动取液器 模板dna等 2 在0 2mlpcr微量离心管中加入缓冲液 的溶液各5 l 模板dna 引物1和5 l引物2 双蒸水 3 煮沸之后冰浴 低速离心 按照1单位 l加入 4 扩增dna片段的反应程序 将微量离心管放入pcr仪中 盖上样品池盖 在的条件下预热5min 再设置反应程序为 以上过程循环30次 最后一次延伸条件为 5 按照pcr仪器操作要求运行反应程序 5 l10倍浓缩的pcr 4种脱氧 核苷酸 1 l 5 l 29 l 5min 2min taqdna聚合酶 94 94 30s 55 30s 72 1min 72 1min 2 dna分子的测定 1 配制二苯胺试剂 分别配制a液 1 5g二苯胺溶于100ml中 再加入1 5ml浓硫酸 用棕色瓶保存 和b液 体积分数为0 2 的溶液 将0 1mlb液加入10mla液中 混匀 2 条件 取一定量扩增前和扩增后的溶液分别放入等量的二苯胺试剂 混匀后观察颜色变化 用加热上述溶液 3 现象 出现现象 3 定量分析方法 如果需要进行定量分析 可以采用或 前者需要使用 后者需要使用等 冰醋酸 乙醛 沸水浴 蓝色 紫外分光光度法 琼脂 糖凝胶电泳法 紫外分光光度计 电泳仪 问题探究 1 实验过程分析 1 离心的目的是什么 在离心的过程中 微量离心管的盖子为什么一定要盖严 答案离心的目的是使反应液集中在离心管底部 提高反应效率 微量离心管的盖子一定要盖严 防止实验中脱落或液体外溢 2 在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁 目的是什么 答案离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀 答案 3 pcr实验中使用的微量离心管 取液器 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌 为什么这样操作 还有哪些操作与此目的相同 答案为避免外源dna等的污染 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 取液器上的枪头都必须更换 答案 2 结果检测 1 实验中为什么要测定dna的含量 答案实际操作过程中会有许多因素影响dna含量 所以需要对dna含量进行测定 2 如何判断dna扩增成功 答案 可以通过计算dna含量来评价扩增的效果 电泳检测的方法 可以通过在紫外线下直接观察dna带的分布及粗细程度来评价扩增的效果 3 pcr扩增过程可能会出现哪些异常结果 答案样品产物少 或产生新的dna 答案 拓展应用 3 进行pcr反应的具体实验操作顺序应为 设计好pcr仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分 进行pcr反应 离心使反应液集中在离心管底部a b c d 答案 解析 解析pcr反应的操作步骤一般分为准备 包括配制配方及将各配方放于实验台上 移液 混合 离心 反应 pcr仪是一种自动控制温度的仪器 设计好循环程序就可以进行反应了 4 近20年来 pcr技术 多聚酶链式反应 成为分子生物学实验室的一种常规实验手段 其原理是利用dna半保留复制 在试管中进行dna的人工复制 如图 在短时间内 将dna扩增几百万倍甚至几十亿倍 从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体 1 加热使dna双链间的键完全打开 称为 而在细胞中是在酶的作用下进行的 答案 解析 氢 解旋 解旋 解析pcr技术利用热变性原理使dna双链之间的氢键断裂 称为解旋 而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂 答案 解析 2 如果只需要大量克隆模板dna中间的某个特定区段 应该加入种特定的引物 当温度降低至55 时 引物与两条 舒展 的模板链的特定位置结合 在dna聚合酶的作用下 只能在引物的端连接脱氧核苷酸 两条子链的延伸方向都是 两 3 从子链的5 端向3 端延伸 解析pcr分为三个基本反应步骤 变性 94 退火 55 延伸 72 其特异性依赖于与靶序列互补的引物 引物是两段与待扩增dna序列互补的片段 两引物之间的距离决定扩增片段的长度 由于dna聚合酶不能从头开始合成dna 只能从引物的3 端延伸dna链 则dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 解析pcr技术与细胞内的dna复制不完全相同 除了需要模板 原料 酶以外 至少还需要液体环境 稳定的缓冲溶液 每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等 答案 解析 3 pcr技术的必需条件 除了模板 原料 酶之外 至少还有三个条件 即液体环境 适宜的和 前者由自动调控 后者则靠来维持 温度 酸碱度 pcr仪 缓冲液 解析一个dna分子连续复制四次之后 形成16个dna分子 15n标记的dna分子有2个 则15n标记的dna分子占全部dna分子总数的比例为1 8 答案 解析 4 通过pcr技术使dna分子大量复制 如果将一个用15n标记的dna分子放入试管中 以14n标记的脱氧核苷酸为原料 连续复制四次之后 则15n标记的dna分子占全部dna分子总数的比例是 1 8 问题导析 问题导析 1 解旋是使dna双链间的键断裂 pcr技术是利用dna的原理 细胞内是在酶的作用下解旋 2 dna分子不论复制几次 含有15n标记的dna分子都只有个 答案 返回上页 氢 热变性 解旋 2 课堂小结 放入pcr仪扩增 引物 复性 当堂检测 1 pcr利用了dna的哪种特性来控制dna的解聚与结合a 特异性b 稳定性c 热变性d 多样性 2 3 4 5 1 答案 2 符合pcr反应条件的一项是 稳定的缓冲液环境 dna模板 合成引物 四种脱氧核苷酸 dna聚合酶 dna解旋酶 限制酶 温控设备a b c d 答案 解析 2 3 4 1 5 解析pcr反应模拟了生物细胞内dna复制的条件 只是无需解旋酶 可热变性 也不需要基因工程的工具酶 限制酶 解析pcr是一种体外迅速扩增dna片段的技术 在高温条件下 把dna的双链打开 缓慢冷却后 又重新结合 需要耐高温的dna聚合酶 同时 还需要引物 从引物的3 端连接脱氧核苷酸 3 下列关于pcr的描述中 正确的是 pcr是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增dna利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列a b c d 答案 2 3 4 1 5 解析 4 如图所示为pcr扩增的产物 请分析此产物是哪次循环的产物a 第一次循环b 第二次循环c 第三次循环d 第四次循环 解析 2 3 4 1 答案 5 解析在pcr反应中 以引物为标记 第一次循环时 以加入的dna为模板 两条dna链可分别由引物 和引物 与其结合并在dna聚合酶的作用下延伸 所以形成的dna中只有一种引物 从第二次循环开始 上次产生的dna分子又可作为模板参与反应 所以会形成dna分子两端均含引物的情况 如下图所示 因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物 2 3 4 1 5 5 多聚酶链式反应 pcr 是一种体外迅速扩增dna片段的技术 请回答下列问题 1 dna的两条链是反向平行的 通常将的末端称为5 端 当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后 dna聚合酶就能从引物的开始延伸dna链 解析一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基 另一端是游离的磷酸基团 含羟基的一端是3 端 含磷酸基团的是5 端 引物的5 端与模板链的3 端结合 然后沿着引物的3 端延伸 耐高温的taqdna聚合酶的发现是实现pcr的关键 该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来 pcr一次循环要经历变性 退火和延伸三个阶段 答案 解析 磷酸基团 3 端 2 3 4 1