实验十三 转化子的鉴定.doc

实验十三 转化子的鉴定一原理 采用煮沸法快速提取阳性克隆质粒DNA，对提取的DNA电泳鉴定对与设计大小一致的质粒DNA进行目的DNA片段PCR扩增，对扩增产物进行电泳若扩增产物中出现特异条带，则可初步确定所得到的转化子力含目的基因的克隆。(一)煮沸法快速提取质粒DNA 1.取一张白纸，剪成培养皿大小，打上小格，每个小格标上号贴在盛LB培养基的培养皿上。将散落在转化培养皿上白色菌落(蘸色菌落中载体质粒一般未插入片段)，分别接种到每一小格中，37培养过夜。 2.用已灭菌的扁平牙签，按种编好号的白色苗落的细菌至相应编号的含氨苄青霉素的LB液体培养基试管5ml15ml中，于37剧烈振摇下培养过夜。 3.将15ml培养物倒人15ml微量离心管中，用微量离心机于4以12 000 rmin离心30s，将剩余的培养物贮存于4。 4.吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 5.向含细菌沉淀的微量离心管中加入350l STET，重悬菌体 6.加25l新配制的10mgml溶菌酶溶液，振荡3秒钟以混匀之 7.将离心管放人煮沸的水浴巾，时间恰为10s。 8.用微量离心机于室温以12 000 rrain离心10mm。 9.用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。 10.在上清液加入40l 5molL乙酸钠(pH5.2)和420l异丙醇，振荡混匀，于室温放置5min。 11.用微量离心机以15 000rmin离心 12.小心吸去上清液，将离心骨倒置于张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。4以12 000r111111离心振荡混匀，于室温放置15nun，回收核酸沉淀， 13.加lml70乙醇。以15 000rmin离心l0min。 14.小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。除去管闭上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发完，使管内无可见液体。 L5.用50l含无DNA酶的胰RNA酶(20gml)的TE(pH8.0)溶解核酸，稍加振荡，贮存于-20。(二)对所提取的阳性质粒DNA进行PCR扩增鉴定 取0.2ml微离心管编号加入下列成分： 10 X PCR buffers 3l引物 2l4dNTPs(25mmolL) 3l待鉴定质粒 DNA 4lddH20 17lTaq酶 1l 10 000rmin离心，5s，混合PCR反应液。 将微离心管置PCR仪上，935变性30s，55退火30s,72.5延伸90s,30循环，之后725再延伸7分钟，4保存备用。(三)电泳鉴定PCR产物 1灌胶称取0.15g琼脂糖，加入电泳缓冲液15ml，微波炉加热融化。 2向胶中加入4l EB。 3向胶灌入事先用透明胶布封好并安好点样疏子的微型电泳槽。 4. 胶凝后，点样。 取一小块封口膜，加入l0l PCR产物及3l溴酚蓝指示剂，混匀，点入微型电泳槽上点样孔内。分子量Mark用pBR322Hinf I，点样量为2l DNA加8l电泳缓冲液加3l溴酚蓝示剂，也可用DL2000直接点样5l。 5. 50V电泳30分钟紫外灯下观察结果。三、试剂1STET 0.1molL NaCl 10mmolL Tris-HCI(pH8O) lmmolL EDTA(pH8.0) 5% Trilon X1002溶菌酶(10mgm1)溶菌酶10mg，加lOmmolL Tris-HCI(pH8O)至1ml.33molL 乙酸钠(pH52) 无水乙酸钠 20.4g ddH2O 10ml用冰乙酸调pH52，加ddH2O定容至50ml4无水乙醇5. 70乙醇6胰RNA酶(20gml) lOmg胰RNA酶，加lml lOmmolL Tris-HCl(pH7.6)、15mmolL NaCI中，配成10mgm1的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装成100l包装保存于-20。 使用前，取一微离心管，加入3l lOmgml胰RNA酶及15l TE缓冲液，混匀，即成含20g/ml胰RNA酶的TE.lmmol-bffTA(pH8r，)7. TE缓冲液（PH8.0） 10mmol/L TrisHCI(PH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0)8电泳缓冲液： 40mmolL TrisHCI(pH8O) 20mmolL NaAC 2mmolL EDTA配制方法：先50倍电泳缓冲液,用时取5ml，重蒸水稀释至250ml。50倍电泳缓冲配制方法：Tris 121.1g无水NaAC 41.0gEDTANa2 18.6g先用100ml重蒸水加热搅拌溶解后再用冰乙酸调节pH至8.0(大约25毫升)然后加蒸水定容至500ml。11kgcm2灭菌20分钟。9溴酚蓝指示剂： 称取溴酚蓝200mg，加重蒸水10ml，在室温下过夜，待溶解后阵称取蔗糖50g，加蒸馏水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至lOOml，加10molL NaOH 12滴，调至蓝色。10EB：(10 mgml溴化乙锭)配制方法：溴化乙锭 1 g ddH2O 100 m111琼脂糖12，pBR322/Hinf I分子量大小(bp):163,517,506,396,344,298,221,220,154,7513DL2000分子量大小(bp):2000、1000、750、500、250、10014氨苄青霉素氨苄青霉索(Amp)临用时用无菌水配制在无菌试管中，浓度为lOOmgml.四、仪器与器材1微型台式高速离心机2. 0.5ml微离心管31.5ml微离心管40.2ml薄壁离心管(PCR管5. 微型电泳槽6电泳仪7微波炉8微量加样器9微量加样器吸头(Tip)10牙签10吊菌环11培养皿12试管五说明 对可能含目的基因的克隆菌进行鉴定睥方法很多，经常合并使用，一般是提取DNA后，对DN