实时荧光定量PCR检测人IL 9 mRNA方法的建立及应用.docx

实时荧光定量PCR检测人IL 9 mRNA方法的建立及应用来源：创新医学网 作者：杨先知1,史烨1,柳迎昭2,陈建作者单位：1.江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学和免疫检验学系, 江苏 镇江 212013; 2. 江苏大学附属人民医院内科， 3.检验科， 江苏 镇江 212002【摘要】目的：建立检测人白介素9 (interleukin9，IL9) mRNA的SYBR Green实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR, qRTPCR)方法。方法： 分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，经PMA和离子霉素刺激活化后提取总RNA并逆转录成cDNA。扩增产物与pMD18T载体连接构建质粒标准品。采用qRTPCR方法检测IL9 mRNA的表达水平。评价该方法的线性及特异性，应用该方法检测Graves病患者PBMC中IL9 mRNA 表达水平。结果： 建立了人IL9的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法。该法的标准曲线相关系数r2为0.9950.998，熔解曲线分析产物为单峰。Graves病患者PBMC中IL9 mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(P0.01)。结论： 建立的检测人IL9 mRNA的SYBR Green实时荧光定量PCR方法灵敏、特异性好，为进一步临床应用提供了实验基础。【关键词】 白细胞介素9; 实时荧光定量PCR; SYBR GreenEstablishment and application of the realtime fluorescence quantitativePCR assay for detection human IL9 mRNA expressionYANG Xianzhi1, SHI Ye1 , LIU Yingzhao2, CHEN Jianguo2, TIAN Jie1, LIU Yan1, LIU Qingling1,SU Zhaoliang1, TONG Jia1, MA Bin1, SHAO Qixiang1, XU Huaxi1, WANG Shengjun1(1.Department of Immunology, School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013; 2.Department of Medicine; 3.Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Peoples Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002, China)Abstract Objective: To establish a SYBR Green based realtime fluorescence quantitative PCR (qRTPCR) method for detection human interleukin9 (IL9) mRNA expression. Method: The specific primers were designed according to the conserved sequence of human IL9 gene. Total RNAs were extracted from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which were stimulated by PMA and ionomycin, then the RNAs were transcribed reversely into cDNAs. The plasmid standards were constructed. The sensitivity and specificity of the method were evaluated. The relative expression levels of human IL9 mRNA in PBMCs from patients with Graves disease (GD) and healthy controls were detected by this method. Results: The coefficient of correlation of the standard curve of this method was 0.995-0.998, melting curve analysis showed single peak. The relative expression levels of human IL9 mRNA in GD group were higher than that in healthy control group (P0.01). Conclusion: The method to detect IL9 by SYBR Greenbased qRTPCR was good in sensitivity, specificity and linear function. It can be used as a standard method of qRTPCR for detection of human IL9 expression.Key words interleukin9; realtime fluorescence quantitative PCR; SYBR Green早先认为IL9是由Th2细胞分泌的一种细胞因子，在抗寄生虫感染及过敏性哮喘中发挥重要作用。近期研究发现有一种新的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL9及IL10，称之为“Th9细胞”, 在炎症反应及自身免疫性疾病中发挥重要的作用1-3。我们建立了一种检测人IL9 表达的实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR, qRTPCR)方法，并应用于Graves病患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中人IL9 mRNA的检测，为进一步研究IL9在临床中的应用提供了实验手段。1 材料和方法1.1 材 料1.1.1 研究对象 Graves病患者组22例(男5例，女17例)，平均年龄(31.49.4)岁，均为经江苏大学附属人民医院确诊的初诊患者。健康对照组20例(男5例，女15例)，平均年龄(29.610.3)岁，无慢性疾病及自身免疫性疾病。1.1.2 主要试剂和仪器 人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术有限公司)，RPMI1640培养基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、离子霉素(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒FSK101(ToYoBo公司)，rTaq酶、dNTPs、10PCR 缓冲液、pMD18T载体、BamH 、Hind (TaKaRa公司)，荧光定量PCR试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMixUDG with ROX(Invitrogen公司)，Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪(Stratagen公司)，pMD18T肌动蛋白质粒由本实验室构建并保存。1.2 方 法1.2.1 引物设计及合成 利用Oligo 6.0软件根据基因库中IL9(NM_000590)的序列设计PCR引物。IL9：上游引物5CCAGCTTCCAAGTGCCACTGC3; 下游引物5TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG3;扩增片段125 bp。肌动蛋白：上游引物5CACGAAACTACCTTCAACTCC3;下游引物5CATACTCCTGCTTGCTGATC3;扩增片段262 bp4。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2.2 样本处理 取5 ml肝素抗凝静脉血，使用人淋巴细胞分离液分离PBMC， 用RPMI1640完全培养基调整细胞密度为1106/ml，取1 ml放入24孔板，以50 ng/ml PMA和1 g/ml离子霉素于5%CO2、37刺激培养5 h后收集细胞，加入1 ml Trizol试剂裂解细胞，提取总RNA。用逆转录试剂盒以Oligo(dT)20将总RNA逆转成cDNA。反应条件：42，20 min;99，5 min;4，5 min。合成的cDNA存于-20oC冰箱备用。1.2.3 pMD18TIL9重组质粒的构建 以上述制备的cDNA为模板，利用PCR扩增IL9片段。反应条件：94预变性5 min;94，30 s;58，30 s;72，30 s;35个循环;72，7 min。将PCR产物与pMD18T载体进行TA克隆，经BamH 酶切、BamH 和Hind 双酶切及PCR鉴定，阳性克隆送上海英骏公司测序，证实与基因库中IL9序列完全一致。阳性克隆菌株通过LB培养基扩增，抽提并纯化质粒，将纯化质粒稀释成102107/l作为标准品，于-20冰箱保存备用。1.2.4 标准曲线的制备 以稀释的标准品作为模板在荧光定量PCR仪上进行扩增，制备标准曲线。根据试剂盒说明：50 2 min;95 预变性2 min;95 ，15 s; 58(IL9)/56 (肌动蛋白)，20 s;82(IL9)/86(肌动蛋白)8 s;扩增40(IL9)/30(肌动蛋白)个循环。为避免引物二聚体干扰，分别在82(IL9)/86(肌动蛋白)收集荧光信号。扩增结束后由仪器软件绘制标准曲线。1.2.5 特异性的评价 标准品及临床标本cDNA在荧光定量PCR仪上进行扩增后进行熔解曲线分析，检测PCR产物是否为目的产物，分析该方法的特异性。1.2.6 样本IL9 mRNA相对表达量的检测 将样本cDNA、标准品、空白对照以上述反应体系及条件同时进行扩增，根据标准曲线分别检测每个样本的IL9和肌动蛋白的拷贝数，并以肌动蛋白为参照校准IL9的相对表达。1.2.7 统计学分析 利用SPSS12.0软件进行统计分析。数据以中位数及四分位数间距(interquartiles range, IQR)表示，组间比较采用MannWhitney检验。以P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 人IL9 mRNA SYBR Green实时荧光定量方法学的建立2.1.1 pMD18TIL9重组质粒的鉴定 pMD18TIL9重组质粒经BamH 和Hind 双酶切，可见2560 bp的载体片段及164 bp小片段，同时经PCR扩增出125 bp的片段(图1)。质粒测序结果显示其序列与IL9基因序列完全一致，从而证实pMD18TIL9阳性质粒构建成功。1：TaKaRa DL2000 DNA 标准参照物; 2：pMD18TIL9质粒PCR产物; 3：pMD18TIL9 BamH和Hind 双酶切; 4：pMD18TIL9质粒 BamH 酶切; 5：TaKaRa 250 bp 标准参照物图1 pMD18TIL9重组质粒的鉴定结果Fig 1 Identifying result of recombinant plasmid pMD18TIL92.1.2 IL9标准质粒的扩增曲线及标准曲线 将构建成功的pMD18TIL9质粒稀释10倍为107102 拷贝数/l作为模板进行扩增，制备其标准曲线。其扩增曲线见图2a，其标准曲线如图2b所示。相关系数r2 为0.9950.998;斜率M为-3.252。其扩增效率为103%。2.1.3 qRTPCR检测IL9 mRNA方法的特异性 为检验该方法的特异性，在每次扩增后均进行熔解曲线分析，由图3可以看出质粒标准品和临床标本cDNA的扩增产物为单一峰，表明只有IL9目的基因的扩增而无其他杂带，特异性好。2.2 Graves病患者PBMC中IL9 mRNA相对表达水平的检测Graves病组和健康对照组的IL9 mRNA相对表达水平以IL9/肌动蛋白比值表示。图4显示Graves病组和健康对照组的比值分别为0.0003(IQR 0.000040.001)和 0.0018(IQR 0.0010.004)，两者比较，差异有统计学意义(P0.01)。3 讨 论机体内CD4+T细胞是包括许多亚群的异质性细胞，在体内微环境的作用下，能分化成不同类型具有不同免疫功能的亚群，如Th1、Th2、Treg及Th17等 5。Th1主要分泌IFN、IL2 、TNF ，主要介导细胞免疫; Th2主要分泌IL4和IL5，介导体液免疫和抗寄生虫感染;Treg细胞在体内调节Th细胞和Tc细胞使之处于动态平衡从而维护机体的免疫自身稳定6; Th17主要分泌IL17、IL22 等因子，在自身免疫性疾病的发生及抗感染中发挥重要作用7。最近，又鉴定出“Th9”细胞，为已有的Th细胞亚群又增添了新成员。TGF1及IL4的联合作用可使抗原刺激活化的初始型CD4+ T细胞分化为Th9细胞1。Th2细胞在TGF1的作用下也可转分化为Th9细胞2。原认为是Th2类细胞因子的IL9，现认为是由Th9细胞分泌，因此检测IL9的表达对研究Th9细胞分化及其在自身免疫性疾病、慢性炎症、肿瘤等疾病中的作用有着重要的临床和科研意义。Graves病是一种器官特异性自身免疫性疾病，机体产生抗促甲状腺激素受体及甲状腺球蛋白等自身抗体8，其具体的致病机制还未阐明，传统上大多数学者认为Graves病是由体液免疫应答异常所引起的9，但Th9细胞在Graves病中的作用未见报道。本研究中，我们发现Graves病患者外周血中IL9 mRNA的表达水平明显高于健康对照组(P0.01)，这提示患者体内可能存在着Th9细胞的极化及IL9, IL10等细胞因子表达增强的现象，为探究Graves病的致病机制及治疗手段提供了新的思路。本研究建立了一种检测人IL9 mRNA的 qRTPCR方法。在pMD18TIL9质粒标准品为102107/l范围内，该方法标准曲线的相关系数为0.998，说明该方法的线性较好，灵敏度高;斜率为-3.252具有很好的扩增效率(103%)。同时，样本cDNA扩增后的熔解曲线呈单个峰，只有目的基因而无引物二聚体等非特异性扩增产物，说明该方法的特异性较好。因此，本研究建立的检测人IL9 mRNA的qRTPCR方法特异、灵敏，能够准确检测IL9 mRNA的含量，从而为进一步的临床检测提供了实验基础。【参考文献】1 Dardalhon V, Awasthi A, Kwon H, et al. IL4 inhibits TGFbetainduced Foxp3+ T cells and, together with TGFbeta, generates IL9+ IL10+ Foxp3(-) effector T cellsJ. Nat Immunol, 2008,9(12):1347-1355.2 Veldhoen M, Uyttenhove C, van Snick J, et al. Transforming growth factorbeta reprograms the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9producing subsetJ. Nat Immunol, 2008,9(12):1341-1346.3 田 洁,王胜军,许化溪. Th9细胞：一种新型效应性CD4+T细胞亚群J. 细胞与分子免疫学杂志, 2009,25(9):853-855.4 吴 蔚,王胜军,李遇梅,等.皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGF1mRNA表达及意义J. 江苏大学学报:医学版, 2008, 18(3): 255-257.5 Zhu J, Paul WE. CD4 T cells: fates, functions, and faultsJ. Blood,2008,112(5):1557-1569.6 Green EA, Gor