细胞凋亡和细胞自噬.ppt

史娟医科院基础所新科研楼607E mail shijuantt 细胞凋亡和细胞自噬 Outline 1 Historyofapoptosisresearch2 Characterizationofapoptosis3 PhysiologicalSignificances4 ApoptosisSignalingPathways5 RegulationofApoptosis6 ApoptosisandAutophagy 第一节凋亡的研究历史 1842CarlVogetInitialobservationthatcelldeathinpartofnormaldevelopment1972Kerr WyllieandCurrie introducedterm apoptosis todescribecelldeathwithasetofcommonmorphologicalfeatures Celldeletionwascontrolledunderphysiologicalconditionsinadults Deregulationcouldleadtomanydiseases MorphologicallyidenticaltodevelopmentalCDanddistinctfromaccidentalcelldeath 1980WyllieBiochemicalchangesinapoptoticmorphology DNAfragmentation Requiresexpressionofdeathgenes1988Bcl 2wasfoundtobeanti apoptotic1991cedgeneswereidentifiedinC elegan1992Fas APO 1 CD95wasidentified1993Aroleofp53inregulationofapoptosiswasdescribedFasligandwasidentifiedICEwasfoundtobehomologofced 3inmammalianIAPswereidentified1994Theroleofmitochondriaduringapoptosis1996TheroleofcaspasesduringapoptosisReleaseofcytochromecfrommitochondriaduringapoptosiswasdiscovered1997Apafswereidentified NobelPrize2002inPhysiologyandMedicine SydneyBrennerJohnE SulstonRobertH Horvitz fortheirdiscoveriesconcerning geneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath GeneticcontrolofprogrammedcelldeathinthenematodeCaenorhabditiselegans Youcanobservealotbywatching Y Berra 第二节凋亡细胞的特征 凋亡 apoptosis 的形态学特征为染色质凝集 边缘化 细胞皱缩 细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻 细胞出泡形成凋亡小体 细胞凋亡受到一系列相关基因的严格调控 程序性细胞死亡 programmedcelldeath PCD 即是指细胞在一定的生理或病理条件下 遵循自身的程序 主动结束其生命的过程 这种死亡由基因决定的 大多数程序性细胞死亡 呈现细胞凋亡的形态学特征 Necrosis Apoptosis 细胞凋亡与细胞坏死在形态上的主要区别 细胞凋亡细胞坏死 发生条件多为生理性病理性 偶然刺激 单个细胞丢失成群细胞死亡细胞膜发泡 完整破裂 不完整细胞器结构保留破坏细胞核核凝集断裂核破碎溶解染色质均一浓缩细胞皱缩形成凋亡小体细胞膨胀而溶解被邻近正常和巨噬细胞吞噬残余碎片被巨噬细胞吞噬炎症反应无 不释放内容物有 释放内容物 细胞凋亡与细胞坏死在生物化学方面的主要区别 细胞凋亡细胞坏死 基因调节由凋亡相关基因调控与基因调控无关发生条件多为生理性病理性 偶然刺激 能量需要能量不需要能量新的基因转录有无大分子合成需要不需要Caspase依赖性不依赖DNA降解为180 200bpDNA随机性降解成为任意的整数倍的DNALadder长度的片段细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻 MorphologyofApoptoticCell Apoptosis Necrosis ApoptosisVS Necrosis 第三节细胞凋亡的生理学病理学意义 保证个体正常发育 蝌蚪成蛙 昆虫蜕变 淋巴细胞阳性和阴性选择 表皮和指 趾 甲的形成等 维持内环境稳定 清除衰老细胞 DNA损伤的细胞等 如果机体对受损 突变或者衰老的细胞不能及时清除话 就会干扰内环境稳定 防御功能 清除被病原体感染的细胞等 生理学意义 保证个体正常发育 蝌蚪成蛙 昆虫蜕变 淋巴细胞阳性和阴性选择 表皮和指 趾 甲的形成等 Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis Tissueremodeling 脊椎动物的神经系统的发育 CTL杀伤靶细胞 免疫细胞凋亡 细胞凋亡 95 的细胞凋亡胸腺细胞成熟过程中的凋亡阳性选择阴性选择激活诱导的细胞凋亡 activation inducedcelldeath AICD CTL诱导靶细胞的凋亡 穿孔素介导的靶细胞凋亡Fas介导的靶细胞凋亡 lymphoidprogenitor CLP doublenegative DN doublepositive DP ApoptosisandsurvivalduringTlymphocytedevelopment ApoptosisandsurvivalduringBlymphocytedevelopment 物理因素 X 射线 热休克等 化学因素 过氧化氢 乙醇 8氯腺苷 氨甲蝶呤 苯丁酸氮芥 三尖杉酯碱等 生物因素 某些细胞因子表达水平变化 蛋白分子的激活 修饰 降解或构象改变 活性氧的产生等 ApoptosisInducers 病原体侵染 诱导凋亡 HIV抑制凋亡 Poxvirus细胞凋亡不足肿瘤 自身免疫疾病 细胞凋亡过度神经退行性疾病 AD 帕金森症 心肌梗塞 再生障碍性贫血 骨组织坏死 病理学意义 HIVinfectioncausesapoptosis 第四节细胞凋亡的信号传递 细胞外部刺激信号介导的死亡受体信号传递途径 extrinsic 细胞内部的信号传递途径 intrinsicormitochondrial 连接分子 adaptor 具有一些特殊的功能结构域 如DD DED CARD等 同种结构域间具有相互结合的倾向 TheTNFandTNFRsuperfamilies AggarwalBB NatRevImmunol 2003 3 9 745 56 CRD Cys richrepeatsextracellularDD deathdomaincytoplasmicessential StructureofDeathReceptors 胞外区结构相似 有多个富含半胱氨酸保守序列 胞内区均有特殊死亡功能区 约90个氨基酸残基组成的基序 deathdomain DD 死亡功能区无任何酶活性 但可与具有相似死亡结构域的蛋白结合 MechanismsofTRAILFunctioning Twofunctionaldeathreceptors DR4 DR5 Threedecoyreceptors DcR1 DcR2 OPG Homotrimer Capasecascade APPbindsDR6totriggeraxondegenerationandneurondeathviadistinctcaspases NikolaevA etal Nature 2009 457 7232 981 9 Caspase1ICECaspase2ICH 1 Nedd 2Caspase3CPP32 YamaCaspase4TXICH 2ICErelIICaspase5ICErelIIITyCaspase6Mch 2Caspase7Mch 3Caspase8MACHFLICEMch 5Caspase9ICE LAP6Mch 6Caspase10Mch 4FLICE 2Caspase11ICH3Caspase12ERapoptosis specificCaspase13ERICECaspase14MICECaspase15Caspase16Caspase17Caspase18 Caspases cysteineasparticacidspecificprotease C cysteine asp cleaveafterAsp familyofproteaseswithsimilaraminoacidsequence structure substratespecificity 根据Caspase家族成员之间大小亚单位的同源性 可将他们分为3组 炎症组 inflammatorymediators Caspase1 4 5 12 13 14凋亡起始组 apoptoticinitiators Caspase2 8 9 10凋亡效应组 apoptoticexecutioners Caspase3 6 7 DED deatheffectordomainCARD caspaserecruitmentdomain StructureandFunctionofCaspases DED deatheffectordomainsCARD caspaserecruitmentdomains Caspasesareproducedaszymogens LavrikIN JClinInvest 2005 115 2665 72 Schemeofprocaspase 8processingattheCD95DISC LavrikIN JClinInvest 2005 115 2665 72 MechanismsofCaspaseActivation 自活化 autoactivation 是指部分Caspase酶原具有在高浓度或局部高浓度时形成寡聚复合体可自身激活自身的特性 主要为凋亡起始组成员 转活化 transactivation 是已激活的起始Caspase激活其它Caspase酶原的方式 非Caspase蛋白酶活化是Caspase酶原激活的另一方式 例如GranzymeB Activationmodelofcaspases Howcaspaseskill ICAD CAD theinhibitorofCaspase activatedDNase Lamins causinglaminatocollapseandcontributingtochromatincondensation Cytoskeletons celljunctionsDeregulationofproteinactivity RegulationofCaspasesGeneexpressionPhosphorylation nitrosylationa Inactivationofhumancaspase 9byAkt b DirectinhibitionofcaspaseactivitythroughactivesitenitrosylationBcl 2proteinfamily pro vs anti Caspaseinhibitors a 痘苗病毒CrmAandp35 b FLIPs c IAPs DualFunctionsofCaspase 8 Expressionandphosphorylationstateofcaspase 8intumors prognosticmarkerortopharmacologicallystimulatecaspase 8processingfortumortherapy FrischSMCancerRes2008 68 4491 3 SignalTransductionbydeathreceptors AshkenaziA NatRevCancer 2002 2 6 420 30 ImmunolCellBiol 2006 84 87 98 IntrinsicSignalingPathwayActivationrequires Cytochromecrelease ATP dATP Apaf 1 Cytc Apaf 1 procaspase 9 ATP dATP apoptosome Caspase 9activation ExtrinsicSignalingPathwayActivationrequires deathreceptor adaptorproteins FADD TRADD DISC death inducingsignalingcomplex Caspase 8 10activation Centralroleofmitochondriainapoptosis 线粒体跨膜通道 permeabilitytransitionpore PT孔 的开放 线粒体跨膜电位下降 Cytc释放 Cytc Apaf 1 procaspase 9 dATPapoptosome Caspase级联 Smac释放 StructureofApaf 1 Apaf 1 apoptoticproteaseactivatingfactor 1 Inflammasomeininflammation Finkel Science 2001 292 5517 624 626 线粒体PT孔主要由位于内膜的腺苷转位因子ANT和位于外膜的电压依赖性阴离子通道VDAC等蛋白所组成 PT孔开放会引起线粒体跨膜电位下降和cytc 凋亡因子AIF等释放 Bcl 2家族蛋白对于PT孔的开放和关闭起关键的调节作用 促凋亡蛋白Bax等可以通过与ANT或VDAC的结合介导PT孔的开放 而抗凋亡类蛋白如Bcl 2 Bcl xL等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合 或者直接阻止Bax与ANT VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应 Synergismbetweenextrinsicandintrinsicdeathpathwaysbycaspase processedBid Cross talkandintegrationbetweendeath receptorandmitochondrialpathwaysUndersomeconditionscross talkisminimal thetwopathwaysoperateindependentlyCaspaseprocessingofBidinducestranslocationofprocessedBidtomito whereitpromotescytochromecrelease Hengartner Nature407 770 2000 StefanJ RiedlNatureReviewsMolecularCellBiology5 897 907 PathwaystocelldeathinC elegans Fruitfliesandmammals Bcl 2基因家族IAP家族FLIP家族其他 HSP NF kBP53 第五节细胞凋亡的基因表达调控 ApoptosisRegulatorsinBcl 2Family Bcl 2亚家族 抑制细胞凋亡的发生 结构上拥有保守的BH1 BH4的结构域和跨膜区 BH1与BH2结构域是抗凋亡蛋白必备的结构域 同时在同源或异源性二聚体和离子通道的形成中发挥重要的作用 主要包括Bcl 2 Bcl XL Bcl W和Mcl 1等 Bax亚家族 促进细胞凋亡 结构上缺乏BH4结构域 只含BH1 BH3和跨膜区 包括Bax Bak Bok BH3亚家族 促进细胞凋亡 结构上仅具有1个保守的BH3同源结构域 主要包括Bad Bim Bid和Bik等 StructureandFunctionofBcl 2FamilyProteins ValentijnAJ BiochemSocTrans 2004 32 Pt3 421 5 Bcl 2family mediatedapoptosis Antiapoptoticmembers BCL 2 BCL XL A1 MCL 1 etc Proapoptotics BID BAD BIM BIK BMF NOXA PUMA etc ModelsforinteractionbetweenBH3 onlyproteins BAX BAK likeproteinsandpro survivalBCL 2 familymembersinsignallinginapoptosis StrasserA NatRevImmunol 2005 5 3 189 200 Smallmoleculesconvertanti deathfactorsintopro deathfactors naturechemicalbiology200812 4 722 Inhibitorsofapoptosisproteins IAPs IAP XIAP c IAP 1 c IAP 2 Survivin Livin tobindwithpro caspaseandinhibittheactivationofcaspases IAPinhibitors Smac DIABLO secondmitochondria derivedactivatorofcaspase directIAP bindingproteinwithlowpH tobindwithIAPsandactivatecaspase 9Omi HtrA2 StructureofBIRdomain containingIAPs RiedlSJ NatRevMolCellBiol 2004 5 11 897 907 BIR一般由80个氨基酸残基构成 全称为杆状病毒IAP重复序列 baculoviralIAPrepeat 为IAP抑制细胞凋亡所必需的 也是所有IAP家族蛋白共有的结构域 事实上含BIR结构域的蛋白质在许多真核生物中都可以见到 但并不是所有含BIR结构域的蛋白都能够抑制凋亡 RING结构是存在于部分IAP蛋白羧基末端的锌指样结构单元 这种锌指样结构具泛素酶活性 能够促进caspase的降解 参与凋亡抑制作用 少数IAP分子存在CARD结构 是位于IAP分子BIR结构和锌指结构之间的一段序列 目前尚未证明CARD结构与抑制凋亡有关 MolecularmechanismofIAP mediatedinhibitionofeffectorcaspases ReialSJetal NatRevMolCellBiol 2004Nov 5 11 897 907 theMultiplemechanismsofIAPs JesenbergerV NatRevMolCellBiol 2002 3 2 112 21 KrammerPH NatRevImmunol 2007 7 7 532 42 StructureofcFLIP FLICEinhibitorprotein family DEDdomain RegulationofNF kBactivationbycFLIP MathewR ClinCancerRes 2006 12 12 3648 51 RegulationofNF kBoncellsurvivalandapoptosis 热激蛋白 heatshockprotein HSP 除参与细胞内一些重要蛋白质分子的构象 稳定性及激酶活性调节之外 HSP另一重要生理功能是对应激状态下的细胞提供保护 近年来的研究证实HSP蛋白家族的重要成员如HSP90 HSP70及HSP27等可以直接作用于细胞的抗凋亡机制 JClinInvest 2005 115 10 2633 2639 HSPandapoptosis P53 apoptosis p53主要功能是监视细胞基因组DNA的完整性 如有损伤 p53可以感知这些损伤 可以促使细胞停留在G1期 进行DNA损伤修复 避免错误DNA的进一步复制 同时 p53可以促进DNA修复蛋白的转录合成 从而促进细胞对DNA损伤进行修复 确保遗传物质的稳定性 一旦这种修复无法完成 p53将促进一系列凋亡相关蛋白的表达 例如Bax PUMA Noxa Fas 从而有效的诱导细胞凋亡 清除受损的细胞 防止细胞癌化 Amodelforp53regulation associationofTP53mutationsandclinicaloutcomeinselectedcancertypes Selectedoncogenicpropertiesofmutantp53andtheirunderlyingmechanisms Interplayofthenuclearandcytoplasmicfunctionsofp53inapoptosis p53andmetabolism KarenH Vousden KevinM RyanWhenmutantsgainnewpowers newsfromthemutantp53field RanBrosh VardaRotterTumoursuppressionbyp53 arolefortheDNAdamageresponse DavidW MeekTheexpandinguniverseofp53targets DanielMenendez AlbertoInga MichaelA Resnickp53andE2f partnersinlifeanddeath ShirleyPolager DoronGinsbergThefirst30yearsofp53 growingevermorecomplex ArnoldJ Levine MosheOrenp53ancestry gazingthroughanevolutionary lensWan JinLu JamesF Amatruda JohnM Abrams HeikoHermeking CancerCell 2007 414 8 p53EnterstheMicroRNAWorld SuzukiHI etal Nature 2009Jul23 460 7254 529 33 ModulationofmicroRNAprocessingbyp53 P53WTp53 aftertreatmentfor8or24hwith0 2gml 1doxorubicin RegulationofmiRNAbiosynthesisbyp53 HeikoHermeking NatureReviewsCancer2012 12 613 626 Regulationofp53pathwaybymiRNAnetwork ApoptoticsignallingpathwaysandtheinvolvementofmiRNAregulation 细胞凋亡的检测 针对凋亡不同阶段特征的检测方法 1 早期检测PS 磷脂酰丝氨酸 在细胞外膜上的检测细胞内氧化还原状态改变的检测细胞色素C的定位检测线粒体膜电位变化的检测2 晚期检测TUNEL Terminaldeoxynucleotidyltransferase mediateddUTPnick end labeling LM PCRLadder 连接介导的PCR检测 TelemeraseDetection 端粒酶检测 3 mRNA水平的检测 针对不同位置的凋亡特征的检测方法 细胞凋亡的形态学检测方法凋亡细胞的光学显微镜和倒置显微镜观察凋亡细胞的荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察凋亡细胞的电子显微镜观察细胞膜相关凋亡检测线粒体相关凋亡检测胞浆蛋白相关凋亡检测Caspase 半胱天冬氨酸酶 活性检测凋亡相关的非Caspase蛋白酶检测胞浆其他蛋白活性检测细胞核相关凋亡检测其他 细胞凋亡的检测方法简述 一 细胞凋亡的形态学检测二 磷脂酰丝氨酸外翻分析 AnnexinV法 三 DNA片断化检测四 TUNEL法五 Caspase 3活性的检测六 WB检测 MorphologyofApoptoticCell 凋亡诱导剂诱导人肺癌细胞株A549发生凋亡 hoechst33258染色 DNAfragmentationandtheappearanceof DNAladder 2 ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC AnnexinV PI AnnexinV FITCFluorescence PIFluorescence TimecourseofapoptosisinTF 1cellsculturedinGM CSF freemedium 第六节凋亡与自噬 VariousModelsofCellDeath Classificationofcelldeathaccordingtothenuclearmorphologyofthedyingcell NatureImmunology4 416 423 2003 Classificationofcelldeathaccordingtocaspaseactivation NecrosisCDCD Apoptosis MitoticCatastrophe ModelofApoptosis like AnoikisCICD Autophagy Paraptosis Oncosis ModelofNecrosis like ApoptosisandAutophagy 自噬 autophagy 就其本义而言就是自己吃自己 指细胞在营养缺乏时靠消化自身细胞器而获得能量以度过饥荒的行为 然而 在后来的研究中发现自噬并不只是细胞的一个生存策略 同时也是细胞死亡的一种方式 如在Parkinson s和Alzheimer s疾病病变的细胞中 经常可以看到细胞自噬的现象 自噬则是利用溶酶体对细胞自身体内的部分细胞质和细胞器进行一系列降解的过程 它的显著特征是形成大量自体吞噬小泡 自噬过程中的细胞骨架虽然解聚 但并不像凋亡过程那样发生明显的细胞骨架降解 self killing self eating JClinInvest 2005Oct 115 10 2679 88 自噬现象最早在哺乳动物中的研究是由Ashford和Porten于1962年通过电子显微镜在人的肝细胞中观察到 但直到1997年日本科学家YoshinoriOhsumi小组在酵母菌中发现自噬相关基因 autophagyrelatedgene Atg 对自噬的研究才有新的进展 诱导细胞发生自噬的因素 饥饿 生长因子缺乏 微生物感染 细胞器损伤 蛋白质折叠错误或聚集 DNA损伤 放疗 化疗等等 自噬的特性 1 自噬是细胞消化掉自身的一部分 初一看似乎对细胞不利 事实上 细胞正常情况下很少发生自噬 除非有诱发因素的存在 细胞外的 如外界中的营养成分 缺血缺氧 生长因子的浓度等细胞内的 代谢压力 衰老或破损的细胞器 折叠错误或聚集的蛋白质等由于这些因素的经常性存在 因此细胞保持了一种很低的基础的自噬活性以维持自稳 2 自噬过程很快 被诱导后8min即可观察到自噬体形成 2h后自噬溶酶体基本降解消失 这有利于细胞快速适应恶劣环境 3 自噬的可诱导特性 表现在2个方面 第一是自噬相关蛋白的快速合成 这是准备阶段 第二是自噬体的快速大量形成 这是执行阶段 4 批量降解 这是与蛋白酶体降解途径的显著区别5 自噬的保守性 由于自噬有利于细胞的存活 因此无论是物种间 还是各细胞类型之间 自噬都普遍被保留下来 Autophagypathwayanditsroleincellularadaptationtonutrientdeprivation LevineB Nature 2007 446 7137 745 7 RegulationoftheAutophagicPathway AutophagyinHealthandDisease 自噬和肿瘤 双刃剑 与凋亡 在肿瘤细胞中一般都存在缺限 不同 自噬是被优先保留的 自噬基因敲除的动物自发肿瘤增多 相反自噬基因敲除后 增加了化疗 放疗 免疫治疗的敏感性 自噬与肿瘤 1 肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点 对营养和能量的需求比正常细胞更高 但肿瘤微环境往往不能如意 如肿瘤发生初始期到血管发生之前 肿瘤长大发生血管崩塌时 肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断 而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机 2 当化疗 放疗后 肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器 损坏的蛋白质等有害成分 而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质 并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件 3 由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会 而对于肿瘤细胞群体而言 需要一部分细胞发生坏死 以引发适度的炎症 有利于血管的长入 吸引免疫细胞分泌生长因子等 研究发现 很多类型的肿瘤在代谢应激时会 组成性 活化PI3K信号以抑制自噬 对不同的细胞 自噬的作用可能不同 相同的细胞在不同的外部因素作用时 自噬的作用可能不同 在肿瘤发生发展的不同阶段 自噬的作用可能不同 肿瘤生长的早期阶段自噬增强 是由于此时肿瘤的血管化作用不足 癌细胞的营养供给有限 需要通过自噬为自身提供营养 肿瘤进入发展阶段后基因变异积累 使包括Beclin1在内的众多抑癌基因失活 自噬活力降低 对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同 自噬功能不全的细胞易于坏死 但是坏死组织