（生物医学工程专业论文）甲状腺激素受体βpremrna新剪接方式体外蛋白水平的研究.pdf

天津医科大学硕 学位论文 中文摘要 甲状腺激素受体 t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r t r 属于核受体超家族的成员 广泛分布在各种组织中 甲状腺激素通过与甲状腺激素受体结合 作用于转录 过程实现其对靶基因的正性 负性调节 对于机体的正常分化发育和代谢平衡具 有十分重要的作用 t r 存在2 种主要的亚型 t r a 和t r l 3 而由于转录起始点 以及剪切方式的不同 每种亚型又包括若干同功体 i s o f o r m s 主要的有t r a l t r a 2 t r a 3 t r a a l t r a c t 2 t r 3 1 t r l 3 2 t r l 3 3 t r a l 3 3 等 我们新 发现的t r l 3 a 亚型 在外显子3 4 之间多出了一个外显子n n o v e l 产生了一 种新的剪接方式 本文将在大鼠肝细胞中对两种剪接方式的关系进行研究 构建重组质粒 以p c r 的方法获得目的片段l u c i f e r a g e e g f p c d n a3 n 4 c d n a 3 4 及m i n i g e l i e 利用限制性酶切位点 构建重组质粒p c d n a 3 1 l u c i f e r a g e p c d n a 3 1 e g 尸 p c d n a3 1 c d n a3 n 4 一l u c i f e r a s e p c d n a 3 1 c d n a3 n 4 e g f p p c d n a 3 1 c d n a 3 4 一l u c i f e r a g e p c d n a 3 1 c d n a 3 4 一e g f p p c d n a 3 1 m i n i g e n e l u c i f e r a g e 及p c d n a 3 1 m i n i g e n e e 觎p 重组质粒经酶切鉴定及测序鉴定 证实构建成功 突变重组质粒 利用体外定点突变技术 在构建好的重组质粒 p c d n a 3 1 m i n i g e l i e l u c i f e r a g e p c d n a 3 1 m i n i g e n e e g f p 的外显子n 区 域缺失一个碱基 突变为重组质粒p c d n a 3 1 m i n i g e n e 胪 l u c i f e r a s e p c d n a 3 1 m i n i g e n e n a e u e g f p 又在重组质粒p c d n a 3 1 m i n i g e n e n 出 l u c i f e r a g e p c d n a 3 1 m i n i g e n e n a 8 u e g f p 的外显子4 区域缺失两个碱基 突变为重组质粒p c d n a 3 1 m i l i i g e n e 俨 4 a e t 2 l u c i f e r a s e p c d n a 3 1 m i n i g e n e a 降 4 如旧 脚 突变质粒经测序鉴定 证实构建成功 体外转染 培养大鼠肝细胞b r l 将构建好的重组质粒以相同摩尔数转染 b r l 细胞 4 8 个小时后 r t p c i 水扩增转录本 荧光倒置显微镜下观察绿色 荧光 并运用统计学软件分析荧光素酶的活性值 小基因重组质粒逆转录的结 果扩增出两条带 说明在在大鼠肝细胞b r l 中 两种剪接方式都存在 绿色荧 光的观察显示 转染质粒p c d n a 3 1 m i n i g e n e e g f p 的细胞 视野中可见多 处绿色荧光 转染质粒p c d n a 3 1 m i n i g e n e 陟 阳即的细胞 视野中几乎 找不到绿色荧光 转染质粒p c d n a 3 1 m i n i g e n e p 严口 e 卵p 的细胞视野 中可见多处绿色荧光 分析荧光素酶的活性值的结果表明 转染质粒p c d n a 3 1 天津医科大学硕士学位论文 m i n i g e n e l u c i f e r a s e 的细胞与转染质粒p c d n a 3 1 m i n i g e n e 旷 l u c i f e r a s e 的 细胞 荧光素酶的活性值差别有统计学意义 p 0 0 5 转染质粒p c d n a 3 1 m i n i g e n e 严 铲口 l u c i f e r a s e 的细胞与转染质粒p c d n a 3 1 m i n i g e n e 矿盯 l u c i f e r a s e 的细胞 荧光素酶的活性值差别有统计学意义 p 0 0 5 综上结果表明 所构建的小基因模型在大鼠肝细胞中 可以剪接成两种转 录本 其中剪接方式形成外显子3 n 4 时产生绿色荧光和荧光的酶活性值都要明 显高于剪接方式形成外显子3 4 时产生绿色荧光和荧光的酶活性值 我们可以认 为 在大鼠肝细胞中 t r l 3 a 小基因模型以剪接成为外显子3 n 4 为主导 关键词 甲状腺激素受体可变剪接小基因定点突变 i l a b s t r a c t t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r t r a st h em e m b e r o fn u c l e a rr e c e p t o rs u p e r f a m i l y i se x p r e s s e di na l m o s ta l lt i s s u e so ft h eb o d y t h y r o i dh o r m o n ep l a y sa i li m p o r t a n t r o l ei nb o d y sm e t a b o l i ca n dd e v e l o p m e n t a lr e g u l a t i o nt h r o u g hb i n d i n gt ot ra n d e x e r t i n gm o s to ft h e i rf u n c t i o n sa tt h eg e n o m i cl e v e l t h e r ea r et w o d i f f e r e n tg e n e s t h a te n c o d et w od i f f e r e n tt r s t ra l p h aa n dt r b e t a b e c a u s eo fd i f f e r e n tt r a n s c r i p t s t a r tp o s i t i o na n da l t e m a t i v es p l i c i n g e a c hs u b t y p eh a ss e v e r a li s o f o r m s i n c l u d i n g t r a l t r a 2 t r a 3 t r a c t l t r o 2 t r p l t r 3 2 t r i b 3 t r a l 3 3 t r i ai s an o v e l t r l 3i s o f o r mw h i c hw a si s o l a t e da n di d e n t i f i e di n r a tl i v e r w ef o u n dan e we x o n n b e t w e e ne x o n 3a n de x o n 4 i nt h i sp a p e r as t u d yo ft w ow a y so fs p l i c i n gi n r a tl i v e r c e l li sr e p o r t e d c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n tp l a s m i d t h et a r g e tf r a g m e n tl u c i f e r a s e e g f p c d n a3 n 4 c d n a 3 4a n dm i n i g e n ew e r eo b t a i n e db yp c r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p c d n a 3 1 l u c i f e r a s e p c d n a 3 1 e g 即 p c d n a 3 1 c d n a3 舭 l u c i f e r a s e p c d n a3 1 c d n a m 粥f 尸 p c d n a 3 1 c d n a 3 4 l u c i f e r a s e p c d n a 3 1 c d n a 3 4 e g f p p c d n a 3 1 m i n i g e n e l u c i f e r a s ea n dp c d n a 3 1 m i n i g e n e e g f p w e r ec o n s t r u c t e db yr e s t r i c t i o ns i t e s e q u e n c ea n a l y s i sa n d r e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o nc o n f i r m e ds u c c e s s f u lc o n s t r u c t i o no ft h er e c o m b i n a n t e x p r e s s i o nv e c t o r m u t a g e n e s i s o fr e c o m b i n a n t p l a s m i d o n e b a s eo fe x o n ni np l a s m i d p c d n a 3 i m i n i g e n e l u c i f e r a s ea n dp c d n a 3 1 m i n i g e n e e g f pw a sd e l e t e d b yi nv i t r os i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i st e c h n i q u e s c o n s t r u c t i n gr e c o m b i n a n tp l a s m i d p c d n a 3 1 以胛豇罗 2 口 人砂1 1 l u c i f e r a s e p c d n a 3 1 m i n i g e n e n d e e g f p t w ob a s e so fe x o n 4i np l a s m i dp c d n a 3 1 m i n i g e n e n 出 l u c i f e r a s e p c d n a 3 1 m i n i g e n e 一胪u e g f p w e r ed e l e t e db yi nv i t r os i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i st e c h n i q u e s c o n s t r u c t i n gr e c o m b i n a n tp l a s m i dp c d n a 3 1 m i n i g e l 7 e p 7 l 4 d e l 2 l u c i f e r a s e p c d n a 3 1 m i n i g e n e n a 2 4 a e u e g f ps e q u e n c ea n a l y s i s c o n f i r m e ds u c c e s s f u lm u t a g e n e s i so ft h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r i nv i t r ot r a n s f e c t i o n t h ea m o u n to ft h ep l a s m i d sf o rt r a n s f e e t i o nw a sa d j u s t e dt o t h es 锄em o l ea n dt r a n s f e c t e di n t or a tl i v e rc e l lb r l 4 8h o u r sl a t e r t h er e s u l t sw e r e a n a l v z e db yr t p c r i n v e r t e dm i c r o s c o p ea n dl u c i f e r a s ea s s a y i 咖b a i l d sw e r e i d e n t i f i e di nr t p c t li n d i c a t i n gt h a ta l t e r n a t i v es p l i c i n gp r o d u c e dt w o1 s o f o r m s o b s e r v a t i o n so fg r e e nf l u o r e s c e n c es h o w e dt h a t g r e e nf l u o r e s c e n c e w a sc l e 盯l y v i s i b l ei nt h ec e l l st r a n s f e c t e dw i t hp l a s m i dp c d n a 3 1 m i n i g e n e e 饼p g r e e l l f l u o r e s c e n c ew a sn e a r l yi n v i s i b l ei nt h ec e l l st r a n s f e c t e dw i t hp l a s m i dp c d n a 3 1 m l n i 筚舵 n d e h e g f p a n dg r e e n f l u o r e s c e n c ew a sc l e a r l y v i s i b l ei nt h ec e l l s t r a n s f e c t e dw i t hp l a s m i dp c d n a 3 1 m i n i g e n e n a e n 4 u t e e g f p a n a l y s i s o f l u c i f e r a s ea c t i v i t ys h o w e dt h a tt h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ec e l l st r a n s f e c t e d w l t h p l a s m i dp c d n a 3 1 肭胛咖 z p l u c i f e r a s e a n dp c d n a 3 l m i n i g e n e 酽 l u c i f e r n s ew a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t p 0 0 5 t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ec e l l s t r a n s f e c t e dw i t hp l a s m i dp c d n a 3 1 m i n i g e n e n a e u 4 a u l u c i f e r a s e a n dp c d n a 3 1 协 2 i g e 玎e 1 v 妇1 1 l u c i f e r a s e w a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t p 0 0 5 i i ls 1 1 m m 哪a b o v er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt r l 3 am i n i g e n em o d e lc a nb es p l i c e d i n t o 似ot r a n s c r i 皿i nr a tl i v e rc e l l s a n dw ec a l l b e l i e v et h a tt r l 3 am i n i g e n e r e c o m b i n a i l tp l a s m i dw a sm a i n l ys p l i c e di n t oe x o n3 n 4 i nr a tl i v e rc e l l s k e y w o rd s t h f o i dh o r m n er e c e p t o ra l t e m a r l v es p l i c i n gm i n i g e n e s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s l s i v 天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要 i a b s t r a c t i i l 缩略语 符号说明 1 前言 1日u 舌 l 研究现状 成果 1 研究目的 方法 4 1 1 对象和方法 5 1 1 1 对象 5 1 1 2 方法 7 1 2 结果 2 9 1 2 1 琼脂糖凝胶电泳鉴定p c r 扩增结果 2 9 1 2 2 重组质粒的酶切鉴定结果 3 1 1 2 3r t p c r 测定剪接结果 3 8 1 2 4 绿色荧光蛋白的观察结果 4 0 1 2 5 荧光素酶的活性值分析结果 4 3 1 3 讨论 4 6 1 3 1 前体m r n a 可变剪接分析 4 6 1 3 2 构建重组质粒 4 6 1 3 3 突变重组质粒 4 7 1 3 4 体外转染实验 4 9 结论 5 1 参考文献 5 2 发表论文和参加科研情况说明 5 5 附蜀乏 5 6 综述 7 3 m r n a 前体选择性剪接的研究进展 7 3 综述参考文献 8 3 致谢 8 7 v 天津医科大学硕士学位论文 缩写 b c a b l a s t d b d d d h 2 0 d e p c d n a d n t p e b e c o l i e d t a e g f p l b d p b s p c r r n a t h t r i s t i b t i 迮s 缩略语 符号说明 英文全称中文全称 b i c i n c h o n i m i ca c i d二辛可酸 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l基本局部比对搜索工具 d n a b i n d i n gd o m a i n d n a 结合域 d i s t i l l e dt w i c ew a t e r双蒸水 d i e t h y p y r o c a r b o n a t e焦碳酸二乙酯 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 2 d e o x y n u c l e o s i d e 5 t r i p h o s p h a t e 脱氧核苷三磷酸 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 e s c h e r i c h i ac o l i大肠杆菌 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n增强型绿色荧光蛋白 l i g a n d b i n d i n gd o m a i n配体结合域 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链反应 r i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 t h y r o i dh o r m o n e 甲状腺激素 t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三 羟甲基 氨基甲烷 t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r s 甲状腺激素受体 t h y r o i dr e s p o n s ee l e m e n t s 甲状腺反应元件 v l 天津医科人学硕士学位论文t r 3p r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 月l j 吾 研究现状 成果 甲状腺激素 t h y r o i dh o r m o n e s t h s 通过与广泛分布在各种组织中的甲状 腺激素受体 t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r s t r 结合 作用于转录过程 实现其多 种靶基因的正性 负性调节 对于维持机体正常的分化发育和代谢平衡具有十分 重要的作用1 1j t r 与糖皮质激素 雌激素以及孕激素等激素受体同属于核受体超家族的成 员 它们都能够识别某段特异的d n a 序列 即激素应答元件 h o r m o n er e s p o n s i v e e l e m e n t h r e 并可与之结合而调控其靶基因的转录 t r 由t r a 基因 又称 c e r b a l 和c e r b a a 位于人染色体1 7 q 1 1 2 鼠1 1 号染色体 和t r p 基因 又称 c e r b a 2 和c e r b a f 3 位于人染色体3 p 2 4 3 鼠1 4 号染色体 所编码 t r 基因在脊 椎动物中高度保守 不同种属间同源性很高f 2 3 t n 和t r l 3 基因由于启动子不同 造成的转录不同以及在转录后加工过程中的剪接不同而产生若干同功体 i s o f o r m s 主要包括 t r a l t r a m t r a 2 t r a 2 t r a 3 t r 3 1 t r l 3 2 t r 3 3 t r a i l 3 见图1 4 卅 其中t r q 基因编码的五种受体亚型 它们的作用主要 为调节机体的生长发育 维持甲状腺功能 7 1 t r b 基因编码的四种受体亚型 他 们的作用主要为增加对t 3 的敏感性 保持听力正常 维持t h 对t s h 的负反馈 8 在目前发现的九种亚型中 只有t i h l t r 3 1 t r f l 2 t r 3 3 四种亚型是有功能 的受体 t r 口t r g 15 21 2 04 1 0 n 1皿 嚣 髓 o 2 5 6 2 5 94 1 0 t i t l t 一 5 21 2 03 7 04 0 9 的2 0 2 矗墨窭溃 彩 a 础 c 3 2 5 6 2 的3 7 04 0 9 4 9 2 二 二 尽圆 i x 黯 i t 诌1 3 1 1 4 72 2 7 5 1 4 衄 一 一t 胆 12 31 0 34 0 0 曩圜 锚 o 蠢 懿毒p 3 207 孳ij 7 巧i 叠 a 凸3 15 21 2 0 3 7 04 5 3 盘墨 图1t r s 的各亚型 天津医科大学硕士学位论文t r l 3p r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 鼠 人类 河豚和斑马鱼的聊基因结构很相似 在3 端有6 个共有外显子 c d e f g 和h 又称r t r f l 基因外显子3 8 相当于h t r f l 基因外显子5 1 0 一个保守的t r l 3 2 特异外显子紧邻在第一个共有外显子 外显子c 的5 端 而多 个t r l 3 1 特异外显子位于更上游 其中2 个外显子编码t r l 3 1 的n 末端 还有几个小 的5 非翻译外显子 见图2 t r l 3 2 特异外显子在种属之间变化不大 但t r 3 1 特 异外显子的序列 大小和位置却显示出种属间的较大差异 因为t r l 3 2 特异外显 子在各种属间的相似性 而且它又离t r d 基因第一个共有外显子最近 有人推测 t r 3 2 可能代表了t r f l 基因原始的受体产物 而t r l 3 1 则可能代表了种属间功能的 变异1 9 j t r l 3 3 和t r a l 3 3 目前只见于大鼠 其他种属并没有相关报告 1 0 同t r l 3 1 和t r b 2 一样 t r 3 3 和t 1 l 6 1 3 3 也具有6 个共有外显子 只是n 端不同 v a t t a b l e f b l i l i 2 罐k c i e c ii b 1 3 l i j d i l m l c r l r o t l i t o r t h 厂 1 广 k l l n l i j i i l 图2t r f l 基因结构 t r s 同功体基因呈现组织特异性以及与分化发育有关的阶段特异性表达 编 码各种t r s 同功体的m r n a s 几乎在所有组织中都有表达 但它们各自有其特征性 的分布 t r a l 在骨骼肌和棕色脂肪中最为丰富 t r a 2 在脑区具有优势表达 t r l 3 1 的分布较为平均 但也以脑区 肝脏和肾脏为主 t r 3 2 集中分布在垂体f j 叶和 下丘脑 t r l 3 3 主要分布在肺和肾脏 13 1 t r a 3 3 存在于骨骼肌 心脏 脾脏 和大脑中i l 训 t r s 同功体基因呈现的阶段特异性表达很可能是其介导t h s 调节分 化发育的重要机制之一 在发育早期过程中 大鼠脑中以t r a l 的表达为主 随 着发育进程t r l 3 1m r n a 明显增加 说明t r l 3 1 对介导t 3 的发育调节作用占有主要 地位 而不能与t 3 结合的t r o t 2 和t r o t 3 无论在胚胎 新生和成年大鼠脑中都具有 2 天津医科大学硕士学位论文t r l 3p r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 优势表达i j 我们在研究甲状腺激素受体的过程中发现一个新的甲状腺激素受体同功体 t r l 3 a 它不同于人们熟知的t r l 3 1 和t r 3 2 也不同于w i l l i a m s 2 0 0 0 年报告的 t r y 3 和a 1 3 3 在t r i l l 基因的第3 4 外显子 e x o n 之间多出了一个1 0 8 b p 的 片段 图3 已于2 0 0 5 年获准于g e n b a n k 登记注册 编号为d q l 9 1 1 6 5 经过 对刀捌m r n a c d n a 的序列分析发现 较r r f l l 多出来的这一段序列 1 0 8 b p 的位置并不影响其前后序列的读码框 t r f l a 可翻译出比原t r 3 1 多3 6 个氨基酸 残基的新的受体蛋白 该氨基酸序列同样经g e n b a n k 登记注册 获编号为 a b a 3 9 2 9 4 这3 6 个氨基酸残基是t r l 3 a 与t r l 3 1 的唯一区别 它是t r 家族中 唯一的加长型受体亚型 它的产生很可能是可变剪接的结果 更可能是本来存 在又一个10 8 b p 的外显子 而且此新受体具有d n a 结合区 d b d 和配体结合 区 l b d 只是在原t r l 3 1 的d b d 中间部分多出3 6 个氨基酸 t r l 3 a 当属甲 状腺受体家族的第1 0 个成员 是本实验室在世界范围内最新发现的 迄今由国 内作者在国内发现和鉴定的唯一的新受体 对于此新受体 我们已经进行了初步的研究 在之前的工作中运用r e a l t i m e 实时定量p c r 的方法分析了t r f l am r n a 在大鼠肝 脑 肾 脾组织中的表达 水平 并与t r f l l m r n a 及t r f l a f l l m r n a 表达水平进行比较 结果发现t r f l a t r i l lm r n a 的表达水平亦有明显差异 在不同组织中及各个发育时段 t r f l z j 的表达量均显著高于t r i l l 并且 在t r f l l t r f l a m r n a 的和值中占相当大的比 例l l 引 这一结果为我们提供了新的线索 为了进一步验证t r f l z l 与t r i l l 在细胞 内剪接方式的关系 本实验构建小基因模型 巧妙地利用体外定点突变的技术 通过报告基因的表达量反映出两种剪接方式在细胞内的关系 5 一 t g a a g a g g a c c c a g c a t g a c t a c t a a c c 屯夏孓c t t c t c a c a c c a g a g a c g a g a a g a c a g g g a t t t g g t t c c a t a c a g a c a c c a g t t c t a c c t c t c t g c a t t c g g t c t g g a t g t t g t c c t c a a g g c a g t g g g a c c c t g a g g g a c 园 区 a c g g a c t g g a c a 3 图3 本实验室克隆的t r i b a c d n a 全序列 注 黑体字部分为多出的1 0 8 b p 序列 其余序列与t r l 3 1 c d n a 完全 相同 编码序列共1 4 9 4 b p 天津医科火学硕十学位论文t r l 3p r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 研究目的 方法 以外显子和内含子为单元的基因结构形式在真核生物中普遍存在 人类基 因中的大多数都含有内含子 通过去除内含子 连接外显子能够形成成熟的 m r n a 这一加工过程称为r n a 的剪接 1 7 1 它包括组成性剪接 c o n s t i t u t i v e s p l i c i n g c s 和选择性剪接 a l t e r n a t i v es p l i c i n g a s 选择性剪接是指选择性地 对p r e m r n a 不同的剪接位点的组合剪接加工 形成不同的成熟r n r n a 进而 产生结构和功能不同的蛋白质的过程 8 1 在进行前体m r n a 剪接的研究中 小基因模型 l9 j 是一种新发展起来的有效 的研究手段 所谓小基因是某一基因中的一个片段 因其片段短而得名 用于 组成型剪接分析的小基因除包含2 个相邻的 在剪接时被 二选一 剪接的外 显子外 还包含它们两侧的外显子及这些外显子之前的内含子 就选择性剪接 的研究而言 将包含小基因的表达质粒与选择性剪接因子共转染细胞 而后通 过r t p c r 半定量方法并配合限制性内切酶鉴定和统计学的方法对被剪接的小 基因产物进行分析 可了解该小基因被剪接的方式及表达量的变化 从而了解 该选择性剪接因子的作用1 2 们 在t r 3 转录本m r n a 水平的工作基础上 2 本文利用两种报告基1 因 r e p o r t e r g e n e 增强型绿色荧光蛋i 刍 e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n e g f p 及荧光素 酶 l u c i f e r a s e 对小基因模型的剪接方式在蛋白水平上进行鉴定 报告基因是一种 编码可被检测的蛋白质或酶的基因 也就是说 是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基剧2 2 j 把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因 或 与其它目的基因相融合 在调控序列控制下进行表达 从而利用它的表达产物 来标定目的基因的表达调控 筛选得到转化体 另外本文运用体外定点突变的 技术改造构建好的小基因模型 利用改变转录本的读码框 产生不同蛋白分子 从而分析鉴定两种剪接方式在蛋白水平上的表达量 4 天津医科大学硕士学位论文t r 3p r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 t r1 3 p r e m r n a 可变剪接蛋白质水平的体外研究 1 1 对象和方法 1 1 1 对象 1 1 1 1 菌种 细胞和载体 大肠杆菌e c o l i d h 5 a 为本室保存 质粒p c d n a 3 1 p e g f p c 1 p g l 3 c o n t r o l 为本室保存 如图4 5 6 p g e m te a s y 体系购自美国p r o m e g a 公司 大鼠正常肝细胞b r l 购自上海中科院细胞库 鳟 s 二 0 1 0 s r l el 3 e i b a s 韩i f 2 5 图4 p c d n a 3 1 质粒图谱 能 i a s e l 5 1 s f l a 8i 胁一i t c 一昂棚7 o a g e i 川 十一 t 涨7 k b 1 叭s v 北 j 0 警j 一 4 一 k a 一 m l 3 s v 4 0 0 3 3 1 i m l u 肾j 1 爱 图5 p e g f p c 1 质粒图谱 天津医科大学硕十学位论文t r bp r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 图6p g l 3 c o n t r o l 质粒图谱 1 1 1 2 主要试剂 d n am a r k e rd l 2 0 0 0 限制性内切酶n o ti e c o ri 勋刀i x b ai h i n di i i 购自宝生物公司 高保真d n a 聚合酶k o df x d n t p s o p nl 酶购自东洋纺 公司 t 4 d n a 连接酶 r n a s e 抑制剂 逆转录酶 m m l v 为i n v i t r o g e n 公司 产品 d n a 凝胶回收试剂盒 超纯质粒提取试剂盒为t i a n g e n 公司产品 o l i g o d t 氨苄青霉素为北京鼎国生物技术公司产品 t r i z o l 和细胞转染用 l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 试剂盒购自i n v i t r o g e n 公司 l u c i f e r a s ea s s s ys y s t e m r e c o m b i n a n tl u c i f e r a s e 购自p r o m e g a 公司 酵母提取物 y e a s te x t r a c t 胰蛋白 胨 t r y p t o n e 琼脂 a g a r 均为g i b c ob r l 公司产品 胎牛血清为h y c l o n e 公司产品 d m e m 培养基为g i b c o 公司产品 胰蛋白酶为北京鼎国生物技术公 司产品 异丙基硫代一p 一半乳糖苷 i p t g 溴化乙锭 e b 5 一溴一4 一氯 3 一吲哚一p d 一半乳糖苷 x g a l 购自北京鼎国生物技术公司产品 琼脂 糖 焦碳酸二乙酯 d e p c 为s i g m a 公司 其它试剂均为进口或国产分析纯 1 1 1 3 引物 所用p c r 引物以g e n er u n n e r 软件库设计 委托北京奥科生物技术有限 公司合成 1 1 1 4 仪器 耗材 美国s h e l d o n 公司m 2 3 0 0 型二氧化碳培养箱 上海光学仪器厂3 7 x a z 型倒 置显微镜 2 5 c m 2 培养瓶 2 4 孔细胞培养板为美国c o m i n g 公司产品 a u t h o r i z e d t h e r m a lc y c l ep c r 扩增仪为英国h y b a i d 公司产品和d n a t h e r m a lc y c l e r4 8 0 扩 增仪为美国p e r k i ne l m e rc e t u s 公司产品 p t c 2 0 0 梯度p c r 仪为m jr e s e a r c h 公司产品 d h 2 0 0 0 凝胶图像采集分析系统 s o r v a l ll e g e n dr t 台式高 6 天津医科大学硕士学位论文t r i bp r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 速冷冻离心机及s o r v a l lp i c o 台式高速离心机为德国h e r a e u s 公司产品 紫高 压电源 亚室温恒温水浴 紫外透射仪为瑞典l k b 公司产品 u v 2 5 0 i p c 紫外 分光光度计为日本岛津公司产品 b i o p h o t o m e t e r 分光光度计为德国e p p e n d o r f 公司产品 电泳仪为大连竞迈公司产品 1 1 2 方法 1 1 2 1 目的片段的获得 1 目的片段e g f p 及l u c i f e r a s e 序列的获得 质粒p e g f p c 1 及p g l 3 c o n t r o l 为本室保存 分别能够表达可以作为报告 基因的加强型绿色荧光蛋白和荧光素酶 以此两种质粒为模板 分别扩增目的 片段e g f p 及l u c i f e r a s e 由于两种报告基因既要用于构建阳性对照质粒 也要 用于构建目的重组质粒 且两种质粒上游酶切位点并不相同 因此 都需要分 别设计两条上游引物 下游引物可以共用 扩增片段命名为e g f p c e g 即 t l u c i f e r o s e c l u c i f e r a s e f 1 目的片段粥即及l u c i f e r a s e 序列的p c r 扩增 a 引物设计 引物设计采用设计软件g e n er u n n e r p r i m e r5 根据g e n b a n k 所发布的基因 序列进行设计 设计分别特异扩增e g f p 及l u c i f e r a s e 序列的引物 经n c b l b l a s t 检索无显著同源性序列 由北京奥科生物技术有限公司负责合成 具 体引物序列和扩增片段长度见表1 表1 目的片段的引物序列和扩增长度 7 天津医科大学硕七学位论文t a l 3p r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 b p c r 反应体系及条件 以提取的质粒p e g f p c 1 及p g l 3 c o n t r o l 为模板 用k o df xd n a 聚合酶 及上述引物 分别扩增目的片段 反应体系 见表2 表2p c r 反应体系 体系组成 单位 l 加样体积 恤1 10 x p c rb u f i e r5 0 d n t p 2 m m o l i 5 0 上游引物 1 0 p m o i 1 5 下游引物 1 0 i t m o l 1 1 5 质粒模板 1 0 k o df xd n a 聚合酶 1 u i z l 1 0 d d h 2 0 3 5 0 p c r 循环参数 9 4 预变性2 m i n 9 8 1 0 s 6 8 2 m i n s 两步法进行2 5 个循环 7 2 延伸8 m i n c 琼脂糖凝胶电泳鉴定p c r 扩增产物 取5 1 x lp c r 扩增产物进行l 琼脂糖凝胶电泳 以核酸分子量标志物 d l 2 0 0 0 p l u s 为参照 估算扩增产物大小 2 目的片段的回收 纯化 利用t i a n g e n 公司t i a n g e lp u r i f i c a t i o nk i t 按照产品说明书进行操作 a 将p c r 产物进行0 8 琼脂糖凝胶电泳 紫光灯下切下含有目的片段的凝 胶 称重 按重量估计体积 1 9 l m l 加入3 倍体积的溶胶液p n 5 0 水浴至胶完全融化 其间可以旋涡震荡以保证胶充分溶解 将所得溶 液加入到一个吸附柱上 1 3 0 0 0r p m 离心3 0s e c 倒掉收集管中的弃液 b 向吸附柱中加入7 0 0 p 1 漂洗液p w 1 3 0 0 0r p m 离心3 0s e c 倒掉废液 再向吸附柱中加入5 0 0 p l 漂洗液p w 1 3 0 0 0r p m 离心3 0s e c 倒掉废液 再次离心 1 3 0 0 0r p m 离心2 m i n 将吸附柱置于室温或5 0 0 c 温箱数分钟 彻底晾干 c 将吸附柱放到一个干净离心管中 加入适量洗脱缓冲液e b 室温放置2 m i n 1 3 0 0 0r p m 离心l m i n 收集d n a 溶液 2 0 0 c 保存 8 天津医科大学硕士学位论文t r j bp r e m r n a 新剪接方式体外蛋白水平的研究 2 目的片段e d n a3 n 4 及c d n a3 4 序列的获得 质粒p e t d u e t 1 豫脚及p e t d u e t 1 t r i l l 为本室构建及保存 分别包含了t r f l a 以及t r i l l 全部外显子 因为以此两种质粒为模板 扩增所需要的目的片段c d n a 3 n 4 及c d n a 3 4o 1 目的片段c d n a3 n 4 及c d n a3 4 序列的p c r 扩增 a 引物设计 引物设计同样采用设计软件g e n er u n n e r p r i m e r5 根据g e n b a n k 所发布的 基因序列进行设计 设计一对能同时特异扩增c d n a3 n 4 及c d n a3 4 序列的 引物 p c r 产物的长度分别为2 1 0 b p 和1 0 2 b p 经n c b ib l a s t 检索无显著 同源性序列 由北京奥科生物技术有限公司负责合成 s e n s e 5 一g g 鱼q 工 c a c t a t c g c t g c a t c a c c 3 a n t i s e n s e 5 5 a t a a g a a t 鱼 q 鱼 q g c a c t t c c c t t c a t a t t t a c 3 b p c r 反应体系及条件 以提取的质粒p e t d u e t 1 t r f l a 及p e t d u e t 1 t r i l l 为模板 用t a qd n a 聚合酶 及上述引物 分别扩增目的片段c d