平滑肌细胞原代培养、传代、冻存方法及所需试剂.doc

01年 中国现代医学杂志 贴壁法原代培养1.1细胞培养1.1.1培养液配制DMEM(美国Corning Cellgro公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲胎牛血清)。1.1.2培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。1.1.3大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150180g。动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。每次取材23只大鼠。贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的23条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm1mm大小的组织块。并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37孵箱内放置24h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养35d。待有细胞从组织块周围游出后换液。1.1.4原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约12min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液34ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。将细胞悬液一分为二接种到新的培养瓶中,补足培养液(每瓶34ml)。未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去。1.3培养细胞的鉴定1.3.1形态学用相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律,并依常规制作电镜标本进行观察。1.3.2免疫组织化学鉴定特异性鼠抗人-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(福建迈新生物技术公司),采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色。（-SM-actin免疫组织化学鉴定）04协和 中国动脉硬化杂志 胰酶消化法培养平滑肌细胞1.1试剂和动物胰酶购自Corning Cellgro公司;-actin抗体购自中山生物技术有限公司;PBS购自Corning Cellgro;新生小牛血清购自HyClone，DMEM为Corning Cellgro产品。雄性Wistar大鼠(2只,体重17525 g)购自中国医学科学院实验动物中心。1.2胰酶消化法原代培养Wistar大鼠处死,迅速取出胸主动脉,浸泡在含无菌PBS的表面皿中,转移到无菌超净台。在表面皿中漂洗主动脉去除残留的血迹,纵向剪开主动脉,把主动脉铺平并使内膜朝上,用镊子来回刮除内膜层,剥离血管中膜。将剥离的血管中膜用眼科剪剪碎,碎片大小在1 mm1 mm左右。装入含0.25%胰酶的玻璃培养瓶中于37条件下消化。当在显微镜下观察组织块表面出现大量细胞时应立即加入血清终止消化,一般消化的时间在3.5 h。终止消化后将玻璃培养瓶置于37空气摇床振摇10 min,继续用吹打的方法使组织块表面的细胞尽可能脱落。待细胞从组织块脱离后,120目细胞筛过滤,转入离心管内离心,弃上清,用含20%小牛血清的DMEM培养基吹打细胞,最后接种于25 mL培养瓶,放入CO2孵箱培养,48 h后换液。1.3传代培养细胞融合后,倒去旧的培养液,加入适量的0.25%胰酶,显微镜下观察,见细胞收缩后去除消化液,加入适量培养液,吹打细胞,以12接种于新培养瓶中,补足培养液,放入37、5%CO2孵箱培养。传代细胞从第三代开始可换用含10%小牛血清的DMEM培养基培养。VSMC至少可以传16代以上,并且从第二代开始平滑肌细胞即可冻存。1.4动脉平滑肌细胞的鉴定相差显微镜下,细胞未汇合之前多数呈梭形,至汇合后,部分区域细胞束状排列,呈典型的“峰和谷”状态。将传代获得的平滑肌细胞接种于盖玻片上,34天后至亚汇合状态,取出细胞爬片,PBS清洗后用4纯丙酮固定1530 min,自然晾干。采用小鼠抗大鼠-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定VSMC肌动蛋白。根据S-P免疫组织化学染色的常规方法,以平滑肌细胞胞浆棕黄色为阳性结果。05重庆医学/基础医学与临床1材料与方法1.1材料912d新生健康清洁级KM小鼠,雌雄不限,购自重庆医科大学实验动物中心。RPMI-1640干粉培养基,D-Hanks粉,标准胎牛血清（购自上海普飞生物公司澳洲胎牛血清）,胰蛋白酶粉(1250)均购自Corning Cellgro公司;青霉素钠、硫酸链霉素购自华北制药厂;鼠抗兔平滑肌肌动蛋白单克隆抗体,购自Zymed公司;SP免疫组化试剂盒,DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司。1.2细胞培养断颈处死小鼠,75%乙醇浸泡消毒2min,分离取出胸主动脉,D-Hanks液清洗去除血污,获干净光滑的血管段,用眼科镊固定血管段端,刀片轻刮去外膜结缔组织,再用眼科剪小心剖开血管,刮去内膜层细胞,将血管段剪成1mm1mm大小的组织块,均匀贴放于25ml培养瓶底面,组织块间隙约23mm,加入含10%胎牛血清的1640培养液23ml,轻晃培养瓶使培养液掠过组织块,翻转静置于37、5%CO2培养箱中34h,再次翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中,半开放式绝对静置培养3d,45d时首次换液。当组织块周围外长的细胞相互汇合,逐渐铺满整个瓶底时,需进行首次传代:吸弃旧培养液,D-Hanks液2ml清洗后吸弃,加0.25%(g/L)胰酶液2ml在37下消化,25min后镜下观察,当细胞回缩、间隙增大时,吸弃胰酶液,加入含10%胎牛血清的1640培养液46ml终止消化,反复吹打瓶壁细胞,形成的细胞悬液按12接种(消化后脱落的组织块可一并传入新培养瓶中)。以后的传代方法相同,传代周期为57d。1.3细胞纯化1.3.1自然纯化法由于进行了前期的血管预处理(去除了大部分内膜和外膜组织),原代培养时虽为多种细胞混杂生长,但平滑肌细胞仍占绝大多数。随着传代次数的增加,平滑肌细胞可排挤其它细胞的生长而优势增殖。1.3.2机械刮除法虽然去除了大部分内膜组织,但培养中仍可见内皮细胞的小范围生长。传代前在镜下用记号笔在培养瓶表面划出内皮细胞生长区域,用弯头吸管在该区域内反复推刮、破坏细胞,吸弃培养液后再进行传代。1.3.3差异贴壁法残留的内膜和外膜组织中含有少量的成纤维细胞,参阅李悦梅等1的方法去除:传代时,将消化吹打形成的细胞悬液静置15min,使部分细胞贴壁,转移培养液至下一个培养瓶中,再次静置、贴壁,重复上述步骤12次,最后一个培养瓶中可获较纯的平滑肌细胞。（根据不同细胞贴壁的时间差纯化细胞）1.4细胞鉴定1.4.1形态学观察应用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。1.4.2免疫细胞化学染色将第5代对数生长期的细胞悬液接种到预先放置2张7mm22mm盖玻片的培养瓶中,培养23d后,取出盖玻片,PBS漂洗5min3次,4%多聚甲醛室温下固定2030min,PBS再次漂洗5min3次,然后按照SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒说明书逐条进行操作(一抗是鼠抗兔平滑肌肌动蛋白单克隆抗体)。细胞培养的几点技巧:相同条件下,小龄动物较大龄动物的组织块有更好的增殖潜能,但动物体积过小又存在取材困难,组织量少的问题,采用912 d新生小鼠取材,既能对血管进行顺利操作,又能保证约90%的组织块有细胞外长。细胞生长具有接触抑制和密度依赖性,一般取23只小鼠的胸主动脉组织块均匀接种于25 mL培养瓶中,间隙约23 mm。当部分组织块周围细胞密集、重叠,停止增殖时,即使整瓶细胞未达到传代标准,仍可用酶消化,吹散密集细胞,11方式传代生长。原代培养初期,当部分组织块漂浮未贴壁,可将其重新摆放至瓶底,翻转干涸23 h后,再浸没于培养液中,使其重新贴壁。该法不会影响同瓶中其他已萌出细胞的生长。小鼠主动脉极细,操作时动作一定要轻柔,避免对血管的过度损伤。一般受牵拉少,剪切时边缘整齐圆滑的组织块萌出细胞的概率较大。细胞传代时,酶消化时间不应固定或硬搬他人经验,应在镜下观察,至胞质回缩,间隙增大时及时终止消化。细胞原代培养的常用方法有酶消化法和组织块法,酶消化法培养周期短,但酶作用时间不易掌握,且消化酶本身对培养细胞有毒性作用,可致培养失败;组织块法虽培养周期相对较长,但操作简便,污染机会小,培养效率高3,4。本研究中由于新生小鼠主动脉细小,可供培养的组织量少,于是采用了组织块培养法。07滨州医学学报 改进的脐动脉血管平滑肌贴块培养法用DMEM培养液反复冲洗,以去掉血管内外的血迹,用眼科镊小心分离下动脉外的结缔组织及血管外膜,然后用眼科剪纵向剪开血管,再用眼科剪将中膜和内膜剪成约12 mm2大小的组织块,用弯头吸管将血管小块移入25 cm2塑料培养瓶,并以47块/cm2的密度均匀排列于培养瓶底(培养瓶底提前用培养液湿润),翻转后加入含有青霉素和链霉素及20%胎牛血清的DMEM培养液约35 m,l放入37、5%CO2培养箱内(湿度100% ),贴壁23 h后再轻轻翻转培养瓶,使组织块浸入到培养液中,开放式培养,一周后取出观察并换液。1.2. 2胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的传代培养:细胞生长融合后,用0. 125%的胰蛋白酶消化传代。先将胰蛋白酶放入37水浴箱预热。用吸管将组织块从培养瓶底轻轻吹打下来,可以将组织块重新移入另一培养瓶继续贴块法培养。用无血清的培养液将培养瓶底冲洗两遍,洗掉残留的血清,然后迅速加入预热的胰蛋白酶,放回培养箱,每隔2 min观察一次,并轻轻拍打培养瓶壁,使细胞从瓶底脱落下来,待镜下观察多数细胞收缩变圆后,向培养瓶中加入含血清的培养液,终止胰蛋白酶的作用,再用吸管轻轻吹打培养瓶底,使细胞脱落,然后将培养瓶中的液体移入离心管, 500 r/min,离心10 min后,弃上清液,然后加入含有10%胎牛血清的培养液将沉淀制成均匀的细胞悬液,按12的比例将细胞悬液移入培养瓶,放回培养箱继续培养。1. 2. 3血管平滑肌细胞的鉴定:取常规传代的细胞,制成均匀的细胞悬液后,移入放有盖玻片的培养皿中培养,待细胞贴壁伸展,生长良好后取出盖玻片,用PBS冲洗2遍,凉干,放入4%的多聚甲醛中固定, 30% H2O21份+纯甲醇50份混合,灭活内源性过氧化物酶,然后热修复抗原,再分别滴加5%BSA封闭液、一抗即抗平滑肌-肌动蛋白(-actin)的单克隆抗体、生物素化山羊抗小鼠IgG、试剂SABC,最后DAB显色,苏木素复染,酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察。2结果2. 1体外培养的胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的形态观察实验中观察到脐动脉组织块贴壁后57d可见有细胞以垂直方向从组织块周围游走出来(见图1),但并不是所有的组织块周围都有细胞游出,离组织块较远的区域也可以看到细胞,此为平滑肌细胞的漂移性生长特性(见图2),细胞形态多样,大小不一,多为长梭形、菱形或星形; 911 d细胞进入对数生长期,细胞生长加速,部分区域可见“峰-谷”样生长(见图3);约2周左右细胞融合成片,甚至相互交叉生长形成多层可以进行传代培养。细胞用胰蛋白酶消化后呈圆形,传代接种于培养瓶4 h就有细胞贴壁, 24 h后细胞伸展,细胞形态多样,胞浆丰富,仍然呈“峰-谷”样生长特性,细胞生长较快,57 d长满瓶底,可以进行传代。本实验取材于脐动脉,采用贴块法成功培养出平滑肌细胞。脐动脉是中动脉,中膜中唯一的细胞是平滑肌细胞,内膜中唯一细胞的是内皮细胞,实验中只去除血管外膜,保留中膜和内膜,将中膜和内膜一起培养,摒弃了传统平滑肌细胞培养实验中单纯培养动脉中膜的模式,将平滑肌细胞和内皮细胞联合培养,不但节约了接种时间,而且减轻了对平滑肌细胞的机械损伤,更有利于原代细胞的游出。本实验将去掉内膜的组织块与未去掉内膜的组织块同时培养,比较发现,未去掉内膜的组织块首先游走出细胞,而去掉内膜的组织块生长周期很长,甚至组织块死亡,没有细胞游出。在原代培养时,可以看到内皮细胞从组织块中游走出来,但随着原代培养的进行,内皮细胞不断的被平滑肌细胞所覆盖,又因在传代过程中,内皮细胞处于最底层而不易被消化下来,所以内皮细胞被淘汰,平滑肌细胞得到纯化。另外,脐动脉为中动脉,内膜中的内皮是单层扁平上皮,很薄,只由一层内皮细胞组成,而中膜较厚,由1040层环行排列的平滑肌细胞组成,显然,平滑肌细胞的数量占有绝对优势;而且参考相关资料和文献6, 7,发现内皮细胞的培养大多数用酶解法,没有用贴法的,因此,不用担心此方法培养平滑肌细胞会被内皮细胞污染。6鄂征.组织培养M.北京:北京出版社, 2001: 29-30.7 R. I.弗雷谢尼著.章静波,徐存拴译.动物细胞培养基本技术指南M.第4版.北京:科学出版社, 2004: 450-451.实验中发现,平滑肌细胞对温度要求特别严格,培养箱内的温度必须为(370. 5),而成纤维细胞在(350. 5)就可以生长。另外,在原代培养中组织块的密度要尽量大,因为组织块之间可以产生微量的相互作用;而且所用的眼科剪必须锋利,以减少对组织块的机械损伤,还可以保持组织块周围的整齐,利于细胞游走出来。在原代培养换液时,为避免将组织块晃动下来,可以先将培养瓶翻转过来,换液完成后再将培养瓶翻转。在传代时,必须把胰蛋白酶的温度控制在37,使其活性最大,保证最大程度地把细胞消化下来。06江西医药 平滑肌细胞培养的综述2.1平滑肌细胞培养技术有文献认为组织块+酶消化法,能够缩短培养时间,更易获得大量较纯的原代细胞,方法是:将剪碎的平滑肌组织块用0.1%胶原酶37消化0.51h后,再接种于培养瓶壁上,37培养箱中静置24h,待组织块贴壁牢固后,再补加含胎牛血清的培养液,37继续静置培养。此种方法细胞游出贴壁时间比传统组织块法短12d,可能是由于组织块被胶原酶消化后其细胞间质变得疏松,细胞容易挣脱间质束缚而萌出的缘故6 （唐槐静,段胜仲,等.胎儿动脉平滑肌细胞培养方法的研究.湖北医科大学学报,1999,20(2):89）2.2平滑肌细胞的生物学特性2.2.1平滑肌细胞生长过程:不同种类的平滑肌细胞培养具有相似的生长过程。贴块法培养的平滑肌细胞,37d开始以垂直方向从组织块边缘迁移萌出;67d细胞进入对数生长期;710d当组织块中大部分细胞萌出后,组织块便自行脱离,其周围细胞密度更加增大,部分区域细胞相互接触交替生长,出现“峰-谷”结构(峰:即多层细胞丘,可达810层,谷:即稀疏排列的单层细胞处,甚至无细胞处),这是平滑肌细胞的特征性生长表现;1014d细胞相互融合。传代细胞的生长特性与原代细胞基本相同,细胞传代的间隔期一般为69d,传代开始时细胞呈圆形,不透明,边缘清楚,而后逐渐伸展贴壁,透明度增高,周界不清,呈典型“峰-谷”样生长。酶消化法培养的平滑肌细胞,培养1d后,大部分细胞已贴壁,换液后继续培养3d,贴壁细胞完全伸展,多数呈长梭型,细胞伸出较长的突起相互接触,部分区域可见典型的“峰-谷”结构,培养79d细胞铺满瓶底。培养细胞达铺满状态所需时间与细胞活力和细胞接种密度有关,细胞活力愈大,接种密度愈大,达到铺满状态所需时间愈短78。2.2.2平滑肌细胞形态学特征:许多研究证实,体外培养的平滑肌细胞具有与体内平滑肌细胞相同的形态学特征。倒置显微镜下观察细胞形态,未贴壁前细胞呈圆形或椭圆形,胞质密度高,不透明,胞核多为卵圆形,有多个核仁,贴壁后细胞胞质透明,彼此融合在一起,细胞呈梭形或多角形,核居中央,呈椭圆形。透射电镜下观察,细胞呈不规则形态,核呈锯齿状,胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体,粗面内质网扩张,游离核糖体丰富,基膜下有密斑。扫描电镜下可见细胞呈带状,平行排列,细胞周边常发出许多丝状突起与相邻细胞的丝状突起交织成网状。此外,在细胞表面还可见许多疏密不等的小泡,可能为平滑肌细胞收缩运动时胞浆外突的形态表现9,1002 动脉平滑肌细胞培养的几个问题组织块大小边缘密度翻面时间观察时间对原代细胞萌发的影响对于贴块法的原代培养来源,由于细胞并非直接获得,而是从组织块边缘长出,其中有一“突破过程”,且细胞萌发后尚需一定的细胞密度才能使其存活、增殖,故组织块大小、边缘、密度均影响细胞萌出与否及细胞存活、增殖。公认的方法是将血管剪成1 mm2大小组织块13。张映娜等认为组织块0.52 mm2范围内,大小影响不大(可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁)4。但如组织块超过2 mm2将增加细胞萌出的阻力。而组织块边缘整齐、光滑、密度亦对细胞生长起着重要作用。组织块边缘过度受损或毛糙不平及组织块密度过稀或重叠将使细胞很难萌出。作者认为剥除内膜、外膜时用力适中,避免机械拉伤,将镊子夹过处切去,剪切时力求一次剪断。切组织块时不要离开培养液操作,保持边缘湿润,组织块密度以中瓶(100 ml)铺放取自68只150250 g大鼠胸主动脉剪碎组织为宜,而小瓶(70 ml)则以34只为佳,且相同重量的大鼠,以月龄较小者为优。翻面时间一般认为36 h,具体时间应根据上述影响因素摸索而定。一般57 d后观察可见细胞从组织块边缘呈放射状长出,但5 d内不宜移动,以免贴壁的组织块脱落,脱落的组织块很难有细胞的萌出。适宜的消化一般认为细胞传代消化以细胞成片收缩,变圆变亮,细胞间隙增大时为宜。它主要取决于胰蛋白酶的浓度,pH值、温度、作用时间,而各实验室报道不一57。过高浓度的胰蛋白酶达到适宜标准的时间短,仅数十秒,不易控制,易使消化过度,浓度过低达到适宜标准的时间过长,易严重损伤细胞膜,细胞难以贴壁。通过实践摸索,作者认为加入0.05%胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合液在温箱内孵育23 min即可达到合适的消化度,0.03%的胰酶和0.02%的EDTA混合液亦可达到同样效果,需及时取出观察,终止消化。实验中还应根据传代后死细胞多少而做适当调整。作者通过对大鼠主动脉平滑肌细胞培养的长期摸索与实践,优化培养方法,使组织贴块法更经济实用,为研究提供大量遗传性质均一、功能状态良好的细胞。第一次传代时机一般的培养方法是选取细胞达亚融合状态时进行传代13。但贴块法原代培养时细胞生长往往不均匀,经常是一些区域已长成致密细胞层,一些区域仍未见细胞生长,这种情况下,当整瓶细胞达亚融合时,致密细胞层已老化。作者通过摸索,认为当原代培养57 d后可移出孵箱观察,如培养液变黄可部分换药继续培养,每隔2 d观察一次。瓶中若有部分区域达到亚融合状态即可传代,或到10 d左右仍未达到亚融合状态,但达到50%左右融合亦可进行传代,为保证传代细胞密度可将细胞传至小体积培养与封闭培养相结合。07 中医儿科杂志1.2细胞培养方法1.2.1原代培养Wistar大鼠20只,断颈处死后,浸泡在75%酒精中5 min,移入超净工作台,在无菌盒盖上迅速取出心肺组织与胸主动脉,在含青霉素100 U/mL、链霉素100g/mL的无菌PBS液的培养皿中,冲洗2次,迅速分离出主动脉和肺动脉,并仔细剥除纤维层和外膜。更换培养皿,用眼科剪沿纵行剖开,内膜面向上,用眼科弯剪自上而下轻刮23遍,以去除内皮细胞。然后再换培养皿,加1滴DMEM,反复剪切成1 mm3小块(剪切10 min左右)。每只大鼠血管组织块可接种3个25 mL培养瓶,瓶内加入3 mL含20%新生牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100g/mL的DMEM培养液,翻转湿润瓶底,然后瓶底向上,用尖吸管从培养皿粘吸出小组织块,摆放在培养瓶底,小块相互间距离以0.5 cm为宜。轻翻转培养瓶,令瓶底向上,置于37、5%CO2培养箱35 h,使小块微干涸;然后轻轻翻转培养瓶,令瓶底向下,让培养液慢慢覆盖于瓶底上的组织小块,置培养箱中静置培养,3 d换1次培养液1。1.2.2传代培养待原代培养的细胞从组织块长出,数量增加至细胞长满瓶壁或占瓶壁60%80%时,即可进行传代培养。吸弃原培养液,向培养瓶中加入PBS液洗净残留培养液,加0.125%胰蛋白酶2 mL,在室温中将培养瓶放于倒置显微镜下观察。待细胞回缩变钝变圆、细胞间隙增大后,立即直立或翻转培养瓶,吸除消化液,用含10%新生牛血清的培养液终止消化,用尖吸管反复吹打瓶壁细胞,使之脱落瓶壁并形成细胞悬液,再分装接种入培养瓶,根据细胞密度按1:2或1:3分装,3 d换液1次,46 d再传代。07中国心血管病研究杂志 大鼠胸主动脉平滑