RPHPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法论文.doc

RPHPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法论文 阿魏酸衍生物（BL）是对阿魏酸（FerulicAcid4羟基3甲氧基肉桂酸）苯环进行改造后的化合物是一个良好的抗氧化剂1文献2报道其清除自由基的能力比阿魏酸明显增强BL结构中溴原子的引入2不仅提高了清除自由基的能力还明显增大了脂溶性这有利于其在生物体内的转运与吸收本文参照文献36建立了反相高效液相色谱方法用于测定BL含量及其有关物质为其质量的可控奠定基础 1仪器与试剂 Waters600717996高效液相色谱仪（二元泵二极管阵列检测器自动进样器Millennium32色谱工作站）；电子分析天平（SartoriusBP211D）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇（色谱纯禹王试剂）；乙酸（分析纯国药集团）；水（娃哈哈纯净水）；30%H2O2（分析纯国药集团）；盐酸（分析纯国药集团）；氢氧化钠（纯度：96.0%西陇化工有限公司）；BL对照品（批号：1101纯度：99.91%由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供）；BL供试品（由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供批号分别为020102020203） 2色谱条件与系统适用性试验 采用AgilentEclipseC18（250mm4.6mm5?m）色谱柱；流动相：甲醇0.1%乙酸（42：58V/V）；紫外检测器检测波长228nm；流速1.0mLmin1；进样量20?L；柱温：40理论塔板数以BL计算不低于5000分离度大于1.5色谱图见图1（主峰保留时间：14.5min杂质1保留时间：5.8min杂质2保留时间：12.8min杂质3保留时间：38.8min） 3溶液的配制 3.1对照品溶液 取BL对照品约10mg精密称定置50mL棕色量瓶中加适量甲醇超声助溶冷却至室温加甲醇稀释至刻度摇匀作为对照品溶液 3.2供试品溶液 取BL供试品约10mg精密称定置50mL棕色量瓶中加适量甲醇超声助溶冷却至室温加甲醇稀释至刻度摇匀作为供试品溶液 4方法专属性考察 分别精密称取BL供试品约20mg置3个25mL棕色量瓶中加甲醇适量超声助溶进行如下破坏试验：酸破坏：加1molL1盐酸1mL室温下静置17h用1molL1氢氧化钠中和加甲醇稀释至刻度摇匀；碱破坏：加1molL1氢氧化钠4mL室温下静置65h85水浴2.5h冷却至室温用1molL1盐酸中和加甲醇稀释至刻度摇匀；氧化破坏：加30%双氧水8mL室温下静置62h85水浴2.5h冷却至室温加甲醇稀释至刻度摇匀 按照“2”项下的色谱条件分别取各破坏溶液20?L进样记录色谱图见图2通过破坏试验可以看出BL在碱、氧化条件下比较稳定放置期间有关物质略有增加在酸性条件下极不稳定有关物质增加明显但有关物质均与主峰分离良好不干扰样品测定说明该方法专属性好 5方法学考察 5.1线性关系考察 精密称取BL对照品（批号：1101）约4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分别置于50mL棕色量瓶中加适量甲醇超声助溶并稀释成约0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度对照品溶液分别取上述溶液20?L进样测定记录色谱图以峰面积A对浓度C（mgmL1）进行线性回归得回归方程A=84486C327332（r=0.9996）表明BL在0.080.32mgmL1浓度范围内呈良好线性关系 5.2仪器精密度试验 取浓度为0.20mg/mL对照品溶液连续进样6次每次20?L以峰面积计算所得RSD为0.57%（n=6）表明测定时的仪器精密度良好 5.3重复性试验 取同一批号的BL供试品按“3.2”项下方法操作配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3个浓度的标准溶液每个浓度平行配制3份共9份照“2”项下色谱条件测定按外标法以峰面积计算样品含量测得平均含量为100.35%RSD为0.50%（n=9）表明方法重复性良好 5.4稳定性试验 取室温下放置的低、中、高3个浓度的供试品溶液各取20?L在04681012h的条件下按照“2”项下色谱条件测定峰面积测得RSD分别为1.7%、1.4%、1.3%表明供试品溶液在12h内稳定 5.5检测限与定量限 精密吸取“3.1”项下对照品溶液加甲醇逐级稀释进样记录色谱图在信噪比（S/N）为3：1时测得检测限为8ng在信噪比（S/N）为10：1时测得的定量限为36ng 6样品含量测定 按“3”项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液各取20?L进样按外标法以峰面积计算样品含量结果表明3批样品含量均在99.0%以上（见表1） 7有关物质测定 取BL供试品约20mg精密称定置25mL棕色量瓶中加甲醇适量超声助溶冷却至室温加甲醇稀释至刻度摇匀得0.80mg/mL的溶液作为供试品溶液精密移取此溶液适量用甲醇稀释100倍得自身对照溶液以不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量7结果表明有关物质均在1%以内（见表1） 8讨论 8.1波长的选择 取BL对照品溶液进行紫外扫描显示其最大吸收波长在228nm和317nm处其中228nm处的吸收值最高因此选择228nm用于BL的含量测定保证测定时有较高的灵敏度 8.2柱温的选择 考察了25、30、40的不同柱温下对样品分离效果的影响实验表明采用40的柱温可减小流动相粘度、降低柱压、缩短出峰时间并改善分离效果故将柱温定为40 8.3流动相的选择 根据BL的化学性质考虑采用酸性流动相可以获得较好效果经过实验比较采用甲醇乙酸水系统作为流动相并且变换流动相比例和乙酸浓度最终确定流动相为甲醇0.1%乙酸（42：58V/V）此条件下分离效果最好保留时间适中 8.4稳定性考察 由于BL的结构特性通常在溶液中不稳定且见光易分解89考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的稳定性发现BL溶液在透明量瓶放置8小时后含量显著降低而在棕色量瓶中的放置12小时含量变化不大RSD小于2.0%但是随着时间增长含量仍会缓慢降低故在试验过程中需采取避光措施并于配制后尽快使用 8.5结论 综上所述本方法操作简便且检测限、定量限、精密度、重复性等均符合要求故本法适用于对BL含量及其有关物质进行测定对于BL的质量控制和使用安全有着十分重要的意义 参考文献 1徐敬侠张首国王林等.5溴阿魏酸的合成研究J.化学试剂34（5）：463466. 2黄华永张鲁勉郑锦鸿.5溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究J.汕头大学医学院学报18（3）：129131. 3李全斌何开勇吴建萍.阿魏酸含量测定方法研究进展J.中医药导报17（3）：117119. 4黄罗生郭健新刘咏梅等.HPLC测定阿魏酸含量的探讨J.中成药26（2）：134136. 5何玲玲.高效液相色谱法测定当归养血丸中阿魏酸含量J.中国医药导报8（3）：6062. 6顾民张亮张正行.HPLC测定逍遥散及当归中阿魏酸