微生物限度检查法2.doc

微生物限度检查法2007-9-19 来源：中国兽药114网 编辑：信风 浏览: 102本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。供试用家兔供试用的家兔应健康无伤，体重1.73.0kg，雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养,在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未经使用于热原检查的家兔；或供试品判定为符合规定，但组内升温达0.6 的家兔；或供试品判定为不符合规定,但其组内家兔平均升温未达0.8，且已休息两周以上的家兔；或三周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前37日内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔1小时测量体温1次，共测4次，4次体温均在38.039.6的范围内,且最高最低体温的差数不超过0.4的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息2日方可供第2次检查用。如供试品判定为不符合规定,且其组内家兔平均升温达0.8或更高时，则组内全部家兔不再使用。每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。试验前的准备 在作热原检查前12日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5，实验室的温度应在1728,在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3，应避免噪音干扰。家兔在试验前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。家兔体温应使用精密度为0.1的肛温计，或其他同样精确的测温装置。肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分半钟，每隔3060分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.039.6的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1。试验用的注射器、针头及一切和供试品溶液接触的器皿,应置烘箱中用250加热30分钟或用180加热2小时，也可用其他适宜的方法除去热原。检查法 取适用的家兔3只,测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38的供试品溶液，然后每隔1小时按前法测量其体温1次,共测3次,以3次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高0.6或0.6以上,或3只家兔体温升高均低于0.6,但升高的总数达1.4或1.4以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。结果判断 在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6，并且3只家兔体温升高总数低于1.4；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6或0.6以上的兔数仅有1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总数为3.5或3.5以下,均认为供试品的热原检查符合规定。在初试3只家兔中，体温升高0.6或0.6以上的兔数超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6或0.6以上的兔数超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总数超过3.5，均认为供试品的热原检查不符合规定。微生物限度检查法微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。包括染菌量及控制菌的检查。 供试品应随机抽样。如遇有异常或可疑的样品，须选取有疑义的样品。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。供试品在检验前不得开启，在检查前及检查中应防止供试品污染菌受损、致死或繁殖。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检查。 检查的全部过程均应严格遵守无菌操作，严防再污染。 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为3035，霉菌、酵母菌培养温度为2528，控制菌培养温度为361 。 细菌、霉菌（酵母菌）计数和控制菌检查，均应作对照试验。 检验结果的报告以1g、1ml或10cm为单位。 培养基及其制备方法：1 、营养琼脂培养基与营养肉汤培养基 见无菌检查法（附录 ）2 、虎红琼脂培养基 胨 5g 虎红（四氯四碘荧光素） 0.0133g 葡萄糖 10g （或0.133虎红溶液10ml） 磷酸二氢钾(KH2PO4) 1g 琼脂 1520g 硫酸镁(MgSO4.7H2O) 0.5g 水 1000ml 除葡萄糖、虎红外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、虎红，分装，115灭菌30分钟。3 、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD) 胨 10g 琼脂 1520g 酵母浸出粉 5g 水 1000ml 葡萄糖 20g 除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热融化后，滤过，加入葡萄糖，分装，115 灭菌15分钟。4 、胆盐乳糖培养基(BL) 胨 20g 牛胆盐 1.3g 乳糖 5g （或去氧胆酸钠0.25g） 氯化钠 5g 水 100ml 磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.3g 除乳糖、牛胆盐外，取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.40.2,煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，115灭菌30分钟。5 、曙红美亚甲蓝琼脂培养基(EMB) 营养琼脂培养基 100ml 2曙红溶液 2ml 20乳糖溶液5ml 0.5亚甲蓝溶液 1.31.6ml 取营养琼脂培养基，加热融化后，冷至60,按无菌操作加入灭菌的其它三种溶液,摇匀，倾注平皿。6 、麦康凯琼脂培养基(MaCC) 胨 20g 1中性红溶液 2.5ml 乳糖 10g 琼脂 1520g 牛胆盐 5g 水 1000ml 氯化钠 5g 除乳糖、1中性红溶液、牛胆盐及琼脂外、取上述成分,混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.20.2，加入琼脂，加热融化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，115灭菌30分钟，冷至约60，倾注平皿。7 、三糖铁琼脂培养基(TSI) 胨 20g 硫酸亚铁 0.2g 牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸钠 0.2g 乳糖 10g 0.2酚红溶液 12.5ml 蔗糖 10g 琼脂 1215g 葡萄糖 1g 水 1000ml 氯化钠 5g 除三糖、0.2酚红溶液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.30.1，加入琼脂，加热融化后，滤过，再加入其余成分，摇匀，分装,115灭菌30分钟，制成高底层(23cm)短斜面。8 、四硫磺酸钠亮绿增菌液(TTB) 胨 5g 硫代硫酸钠 30g 牛胆盐 1g 水 1000ml 碳酸钙 10g 取上述成分，混合，微温使溶解，121灭菌20分钟。 临用前，取上述培养基，每10ml中加入碘溶液(取碘6g与碘化钾5g，溶于20ml水中)0.2ml和0.1亮绿溶液0.1ml ，混匀。9 、沙门氏、志贺氏菌属琼脂培养基(SS) 胨 5g 硫代硫酸钠 8.5g 牛肉浸出粉 5g1中性红溶液 2.5ml 乳糖 10g0.1亮绿溶液 0.33ml 牛胆盐 8.5g琼脂 20g 枸橼酚钠 8.5g 水 1000ml 枸橼酸铁铵 1g 除糖、指示剂、琼脂外，取上述成分混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2 0.1，滤过，加入琼脂，加热融化后，121灭菌20分钟，再加入其余成分，摇匀，冷至约60，倾注平皿。10、胆盐硫乳琼脂培养基(DHL) 胨 20g 枸橼酸钠 1g 牛肉浸出粉 3g 枸橼酸铁铵 1g 乳糖 10g 1中性红溶液 3ml 蔗糖 10g 琼脂 1820g 去氧胆酸钠 1g 水 1000ml 硫代硫酸钠 2.3g 除糖、1中性红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.20.1，加入琼脂,加热融化后,再加入其余成分，摇匀，冷至约60，倾注平皿。11、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基 胨 10g 牛肉浸出粉 3g 氯化钠 5g 琼脂 1520g 十六烷三甲基溴化铵 0.3g 水 1000ml 除琼脂外，取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.50.1，加入琼脂，加热熔化后，分装，121灭菌20分钟，冷至约60，倾注平皿。12、亚碲酸盐肉汤培养基 临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1亚碲酸钠（钾）溶液0.2ml，混匀，即得。13、卵黄高盐琼脂培养基 胨 6g 10氯化钠卵黄液 100ml 牛肉浸出粉 1.8g 琼脂 23g 氯化钠 30g 水 650ml 除10氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.60.1。121灭菌20分钟，待冷至约60，以无菌操作加入10氯化钠卵黄液,充分摇匀,倾注平皿。 10氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋一个，以无菌操作取出卵黄，放入10灭菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。14、甘露醇高盐琼脂培养基 胨 10g 1酚红溶液 2.5ml 牛肉浸出粉 1g 琼脂 1520g 甘露醇 10g 水 1000ml 氯化钠 75g 除甘露醇、1酚红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.40.2，加入琼脂，加热融化后，滤过，分装，115灭菌30分钟，冷至约60,倾注平皿。15、蛋白胨水培养基 胰蛋白胨 10g 水 1000ml 氯化钠 5g 取上述成分混合，加热融化，调节pH值使灭菌后为7.30.1，分装于小试管中,121灭菌20分钟。16、磷酸盐葡萄糖胨水培养基 胨 7g 葡萄糖 5g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 3.8g 水 1000ml 取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.30.1，分装于小试管中，121灭菌15分钟。17、枸橼酸盐培养基 氯化钠 5g 枸橼酸钠（无水） 2g 硫酸镁(MgSO47H2O) 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液 20ml 磷酸氢二钾(K2HPO4) 0.8g 琼脂 1520g 磷酸二氢铵(NH4H2PO4) 1g 水 1000ml 除溴麝香草酚蓝和琼脂外，取上述成分，混微温使溶解,调节pH值使灭菌后为6.90.1，加入琼脂，加热融化，加入指示剂混匀。分装于小试管中，121灭菌15分钟，置成斜面。 注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。18、糖、醇发酵培养基 基础液 胨 10g 0.5酸性复红指示剂 10ml 糖、醇 0.5 （或溴麝香草酚蓝指示液6ml ） 氯化钠 5g 水 1000ml 取胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入指示剂混匀,分装每瓶100ml，121灭菌15分钟。 配制葡萄糖发酵管时，于100ml基础液中加入0.5g葡萄糖,分装于含杜氏管(Durham)的小试管中。121灭菌15分钟,配制其它糖醇发酵管时,将各种糖醇分别配成10溶液,与基础液同时于121灭菌15分钟。以无菌操作将5ml糖醇溶液加入100ml基础液内,分装于灭菌小试管中。 注：糖醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。19、5乳糖发酵管 胨 0.2g 乳糖 5g 氯化钠 0.3g 溴麝香草酚蓝指示液 0.6ml 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 0.2g 水 1000ml 除乳糖和指示剂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入乳糖及指示剂，混匀，分装于含杜氏管的灭菌小试管中，115灭菌15分钟。20、尿素琼脂培养基 胨 1g 葡萄糖 1g 氯化钠 5g 20尿素溶液 1000ml 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2g 琼脂 20g 0.2酚红溶液 6ml 水 1000ml 除尿素和琼脂外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为7.20.1，加入琼脂，加热溶化并分装于锥形瓶，121灭菌20分钟。冷至5055,加入经薄膜过滤除菌的尿素溶液，混匀。尿素的最终浓度为2，分装于灭菌试管中，置成斜面。21、氰化钾培养基 胨 3g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 5.64g 氯化钠 5g 氰化钾试液 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.225g 水 1000ml 除氰化钾试液外，取上述成分，混合,调节pH值使灭菌后为7.50.1，121灭菌20分钟，冷却后，每100ml培养基中加入氰化钾试液1.5ml,分装于12100mm灭菌试管内，每管4ml，立即用灭菌橡皮塞塞紧，置4保存。同时，以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基，分装于灭菌试管中。22、赖氨酸脱羧酶试验培养基 胨 5g 1.6溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 酵母浸出粉 3g L-赖氨酸(DL-赖氨酸) 0.5(1g)/100ml 葡萄糖 1g 水 1000ml 除赖氨酸外，取上述成分，混合，加热溶解后分装，每瓶100ml。加入L-赖氨酸0.5g（DL-赖氨酸1g）调节pH值使灭菌后为6.8,同时以不加赖氨酸培养基作为对照。分装于灭菌的小试管内，每管1ml并滴加一层液体石蜡，121灭菌10分钟。23、绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基（PDP琼脂） 胨 20g 甘油 10ml 氯化镁（无水） 1.4g 琼脂 1820g 硫酸钾（无水） 10g 水 1000ml 取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使