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色谱质谱联用技术 色谱质谱联用技术一、 色谱分析的概述1）按物理状态分类根据流动相的物态：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)根据固定相的物态：气-固色谱法、气-液色谱法、液-固色谱法、液-液色谱法2）按使用的形式分类(1)柱色谱 (2)纸色谱 (3)薄层色谱3）按分离机理分类(1)吸附色谱 (2)分配色谱 (3)离子交换色谱(4)凝胶色谱2、色谱法的特点1) 高选择性 2) 高效能 3) 高灵敏度，适于微量和痕量分析3、色谱法的应用1) 色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析2) 液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。3) 色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术,常用于制备分离，得到高纯样品。4) 色谱质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。4、几个色谱常用术语（以气相色谱图为例）1）色谱图各组分的浓度随流出时间而分布的曲线称为色谱曲线，常称为色谱曲线图或色谱图。2）色谱峰的高度、宽度、半峰宽度峰高(h)：峰高h指色谱峰最高点到基线的距离，一般用cm为单位。峰宽(Y)与半峰宽Y1/2)从色谱峰两侧的转折点(拐点)作切线，在基线上的截距叫峰底宽(y)；简称峰宽；峰高一半处色谱峰的宽度叫半峰宽(y1/2)。由于色谱峰顶呈圆孤形，色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半。3)保留时间(tR):是指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需的时间。调整保留时间(tR)：组分的保留时间与死时间的差值： tR=tR-t0它表示与固定相发生作用的组分比载气在色谱柱中多滞留的时间，实际上是组分在固定相中所滞留的时间。二，气相色谱仪1、GC的分析过程l1）气相色谱主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向与流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。2）由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附或解析，结果在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的样品后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能将样品组分的存在与否变为电信号，电信号的大小与被测组分的量或浓度成比例。GC的分析流程图2、气相色谱仪的构成l 气路系统l 进样系统l 柱系统l 检测系统l 计算机控制及数据处理系统检测系统 检测器是色谱仪的“眼睛”l气相色谱检测器可分为浓度型检测器与质量型检测器：浓度型检测器的响应值和组分的浓度成正比，质量型检测器的响应值和单位时间内进入检测器的质量成正比。常用的浓度型检测器有：热导池检测器(TCD)、电子捕获检测器(ECD)常用的质量型检测器有：氢火焰电离检测器(FID)、火焰光度检测器(FPD)3、分离条件的选择3.1载气及流速的选择热导池检测器常用氢气、氦气作载气氢火焰检测器宜用氮气作载气。氢气：空气：氮气的比例为1：10：1，如氢气3040ml/min,空气300400ml/min ,氮气1-3ml/min。3.2柱温的选择柱温改变时，柱效率、分离度R、选择性及色谱柱的稳定性都将产生相应的改变。3.4进样时间和进样量的选择1)进样速度必须很快2）最大允许进样量应控制在使峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内。4、气相色谱分析4.1气相色谱的定性方法依据：利用色谱图确定各色谱峰所代表的化合物。常用的方法：纯物质对照定性、利用保留值定性、利用检测器的选择性定性等。4.2定量计算方法 归一化法、外标法、内标法等1）归一化法归一化法很直观，容易接受，计算简便、准确，当操作条件如进样量、流速等发生变化时，对计算结果的影响很小，是一种常用的计算方法。缺点是：必需所有组分都出峰。 2）外标法利用标准品做标准曲线，在线型范围内，求得样品的浓度的一种定量方法。3）内标法当只需测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，可采用内标法。内标法是将一定质量的纯物质(非被测组分的纯物质)作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物质和内标物的质量及其在色谱图上相应峰面积之比，求出被测组分的质量分数。选择内标物应遵循的原则：试样中不存在的纯物质，否则会使色谱峰重叠而无法准确测定试样的色谱峰面积；内标物的物理及物理化学性质应与被测物相近，当操作条件发生变化时，内标物与被测物均受到相应的影响。两者相对校正因子基本不变；色谱峰位于被测物色谱峰的附近，且能与被测物色谱峰完全分离；内标物的浓度应与被测物的浓度相近。内标法的优点：不要求各组分全部出峰，无归一化法的限制，即只要被测组分能出峰，不和其他峰重叠，不管其他组分是否出峰或是否重叠，都可以用内标法进行定量分析，而且定量准确，受操作条件影响较小。缺点：选用合适的内标物较为困难，每次都要淮确称量样品和内标物的量，不宜作快速分析。4.3建立气相色谱的方法三、高效液相色谱分析气相色谱法适用于分析相对分子质量较小、沸点较低、热稳定性好的物质，这些物质约占有机化合物总数的25%30%。对于稳定性差、相对分子质量大(400以上)、沸点高的物质，宜用高效液相色谱法进行分析。高效液相色谱法是用液体作为流动相的色谱法。高效液相色谱仪由五部分组成：高压输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统、数据处理系统。1、高效液相色谱仪液相色谱检测器v检测器有：紫外检测器（分为可变单波长检测器VWD和二极管阵列检测器DAD） 、示差折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器等。2、高效液相色谱法的分类及其分离原理固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法3、正相色谱和反相色谱v正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相v反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。试样的溶解性1）能迅速溶于水或甲醇的样品，可采用反相液-液色谱法2）若试样全部或大部分能溶于HCl或NaOH溶液，表示试样属于离子型化合物，可采用离子交换色谱法来分离3）溶于非水溶性溶剂(如己烷、异辛烷、苯、甲苯等烃类)的试样，可选用液-固吸附色谱法3溶于二氯甲烷或三氮申烷的试祥，选用常规的液-液色谱(正相色谱)法和吸附色谱法；各类物质常用的分离方法 四、联用技术质谱法是一种重要的定性鉴定和结构分析方法，但没有分离能力，这一点与色谱法刚好互补，后者是一种很好的分离方法，特别适合于复杂混合物的分离，但对组分的定性鉴别有困难。将两种方法结合起来就可以发挥两者的优点，解决发展混合物的分离和鉴定。质谱可以看成气相色谱或液相的一个检测器，通过测定样品的分子量及结构信息，确定化合物。把两种和多种方法结合起来的技术称为联用技术。质谱的联用技术主要有气相色谱-质谱（GC-MS），液相色谱-质谱（LC-MS），毛细管电泳-质谱（CZE-MS）和串联质谱（MS-MS）等。 4.1质谱概述质谱法是将被测物质离子化，按离子的质核比分离，测量各种离子峰的强度而实现分析目的的一种方法；质谱法灵敏度高于其他结构方法，如IR、NMR等；质量是物质的固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱质谱，利用这一性质可进行定性分析；利用谱峰的强度可做定量分析；质谱图根据质谱解析原理，可从质谱图获得组分 根据质谱解析原理，可从质谱图获得组分的分子量和分子结构信息。4.2质谱的主要应用1、结构分析分子量的测定及结构分析，分子空间构型研究等须和IR 、UV-Vis、NMR等联用2、定量分析定量分析要与GC、LC等联用4.3 质谱仪的基本构成以离子源产生气相离子，再利用质量分析器测质核比，计算出分析物的分子量，是目前所有质谱仪器运作的基本原理。真空系统 质谱仪的离子源、质量分析器、离子检测系统都离不开真空系统。4.3.1进样系统l直接进样、色谱进样4.3.2离子源 1、电子轰击电离源（ Electron impact, EI）利用一定能量的电子与气相中的样品分子相互作用（“轰击”），使分子失去电子，电离成分子离子。当分子离子具有的剩余能量大于其某些化学健的键能时，分子离子便发生碎裂，生成碎片离子。2、化学电离源（ （Chemical ionization,CI） ）引入一定的反应气进入离子化室，反应气在具有一定能量的电子流的作用下电离或裂解，生成的离子和反应气分子进一步反应或和样品分子发生离子分子反应，通过质子交换使样品分子电离。3、快原子轰击源（ （Fast atom bombardment ,FAB Fast atom bombardment ,FAB） ）将样品分散于基质制成溶液，涂布于金属靶上送入离子源中，将经强电场加速后的惰性气体中性原子束对准靶上样品轰击。基质中存在的缔合离子及经快原子轰击产生的样品离子一起被溅入气相，并在电场作用下进入质量分析器。FAB特点1） 离子化能力强，用于强极性、挥发性低、热稳定性差和相对分子质量大的样品2） 得到分子离子峰或准分子离子峰及较多的碎片信息3） 对非极性样品灵敏度下降、低质量区（400）以下产生较多干扰峰；4、电喷雾电离源 （Electrospray ionization, ESI） ）样品溶液从毛细管流出时，电场及辅助气流的作用下喷成雾状的带电液滴，液滴中溶剂被蒸发，使液滴直径变小，发生“库仑爆炸”，把液滴炸碎，此过程不断重复，形成样品离子。ESI特点 1） 灵敏度高（fmolpmol）2） 软电离源，易得准分子离子峰3） 可以形成多电核离子，适用于多肽、蛋白质、糖蛋白、核酸等其他多聚物的分析4） 样品要求易离子化5、基质辅助激光解析电离源（ MALDI） 用小分子有机物作为基质，样品于基质的分子数比例为1(10050000),均匀混合后，在空气中自然干燥后送入离子源，混合物在真空下受激光辐照，基质吸收激光能量，并转变成基质的电子激发能，使基质由固态转变成为气态，形成基质离子，中性样品与基质离子、质子及金属阳离子之间碰撞过程中，发生样品的离子化，从而产生质子化离子、阳离子化分子或多聚体离子。MALDI特点( Matrix- -assisted laser desorption1）准分子离子峰很强，几乎无碎片离子，可直接分析蛋白质酶解后多肽混合物2）样品中杂质的耐受量较大3）适用于多肽、蛋白质、糖蛋白、DNA片段、多糖及其他生物技术产品的分析4.3.3质量分析器Magnetic, Electric SectorsQuadrupole Ion TrapTime - of - flight ( TOF )电磁式经典：带电粒子在磁场中运动受到罗伦兹力的作用单聚焦和双聚焦两种单聚焦磁场分析器 1、单聚焦磁场分析器1）方向聚焦；相同质荷比，入射方向不同的离子会聚2）分辨率不高飞行时间分析器原理：获得相同能量的离子在无场的空间漂移，不同质量的离子飞行速度不同，行经同一距离后到达检测器的时间不同，得到分离。4.3.4 离子检测（1）电子倍增管1518级；可测出10-17A微弱电流；（2）渠道式电子倍增器阵列.5气相色谱- -质谱联用凡是能用气相色谱分析的试样，均适合于 GC GC- -MS MS分析例如：环境污染物的分析 环境污染物的分析香精、香料的成分分析和质量评价 香精、香料的成分分析和质量评价中草药的挥发性成分鉴定 中草药的挥发性成分鉴定药物及其他化工产品的分析 药物及其他化工产品的分析毒物、毒品及违禁药物的鉴定和检测等等。抗紫外剂UV1的GC-MS总离子流图1、TIC图中的每一个峰代表一个组分；、峰的位置就是该组分的色谱保留时间；、峰面积与组分的相对含量有关。4.6 液质联用的基本概念1、 液相色谱-质谱联用时，质谱可看成液相色谱仪的一个检测器，计算机把采集到的每个质谱的所有离子相加得到总离子强度，总离子强度随时间变化的曲线就是总离子流图，总离子流图的横座标是出峰时间，纵座标是总离子强度。2、图中每个峰表示样品的一个组份，由每个峰可以得到相应化合物的质谱图；峰面积和该组份含量成正比，可用于定量。3、LC-MS总离子流图与由紫外检测器得到的色谱图可能不同。因为有些化合物没有紫外吸收,用液相色谱分析不出峰，但用LC-MS分析时会出峰；有些样品紫外有吸收，液相色谱分析出峰，因不能离子化，LC-MS分析时不出峰。电喷雾是一种软电离源,通常很少或没有碎片,谱图中有准分子离子，能提供未知化合物的分子量信息。LC- -MS MS的注意事项1）采用挥发性缓冲液，如醋酸铵、甲酸铵、醋酸、三氟乙酸(TFA)、七氟丁酸(HFBA)等代替硼酸盐、磷酸盐和硫酸盐等；2）pH值应保持相同；3）应采用挥发性的离子对试剂。但应注意更换离子对试剂后保留时间的变化；4）LC用的有机溶剂应与离子化方式一致。反相LC用的极性溶剂与ESI相匹配；正相LC用的非极性溶剂与APCI相匹配；肽质量指纹谱Peptide Mass Fingerprinting （）1、 蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后所得全部肽段的质量图谱。不同蛋白质有不同的氨基酸序列（一级结构），被酶水解后产生的肽段序列不同；同一蛋白质在不同的蛋白质酶裂解后，产生的肽段也不相同。因此，酶切后的肽混合物的质谱具有一定的特异性，故称为指纹谱。2、 将实验测得的蛋白质全部肽段质量数与数据库中蛋白质的理论酶切肽段质量数进行比较，可检索出肽指纹谱有一定相似性的蛋白质，从而鉴定已知蛋白质。肽质量指纹谱操作流程1. 切胶2. 脱色（50%乙腈/50mM NH4HCO3)3. 干胶4. 加入5-10ul解液（50ng/ul测序级胰酶，溶解液含25mM的NH4HCO3），放置冰浴中30分钟，向胶内加入25mM的NH4HCO3溶液10-20ul，以防止在酶切过程中胶块干燥5. 37水浴酶切过夜，16-20小时6. 5%三氟乙酸(TFA)100ul 40 提取1小时，离心取上清；再用2.5%TFA/50%乙腈100ul 30 提取1小时，离心取上清7. 将两次上清混合，干燥备测流式细胞仪主要由五部分组成 1.流动室和液流系统； 2.激光源和光学系统； 3.光电管和检测系统； 4.计算机和分析系统； 5.细胞分选系统1.流动室的基本结构 流动室是仪器的核心部件，被测样品在此与激光相交，得到准确的细胞荧光信息。2.激光源和光学系统 通常以激光作为发光源（氩离子气体激光器和小功率半导体激光器）。被荧光染色的细胞在 激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。3.光电管和检测系统： 通过光电转换器转变成电信号而进行测量。 二种探测器:光电二极管和光电倍增管。 光电二极管对光的敏感度低于光电倍增管,用于探测FSC, 因FSC是强信号。 光电倍增管（PMTs）用于探测SSC,FL1,FL2,FL3,因为它们是弱信号。两类放大器: 线性放大器：输出信号辐度与输入信号成线性关系。 对数放大器：输出信号和输入信号之间成常用对数关系。 放大器的作用:可对信号进行微调。对FSC,SSC,FL1,FL2,FL3可设置放大模式和放大 增益。4.计算机和分析系统 经放大后的电信号被送往计算机分析器。 荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后转换为电信号，再通过模数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。 流式细胞仪系统流程： 标本激光系统流动系统信号处理系统放大系统 计算机系统结果打印流式细胞仪有关的测量参数及数据处理 测量参数：检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择。第一激光（488nm）激发出的 FL1,FL2,FL3,第二激光（635nm）激发出的FL4。 数据处理： 主要包括数据的显示和分析。流式数据一般用一维直方图、二维散点图来表示。测量参数： 1.散射光信号：前向角散射和侧向角散射（细胞的物理固有参数）(1)前向角散射，即FSC与细胞的大小（直径的平方）相关，我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。（一般流式细胞仪能够测量到0.2m0.5m）。 (2)侧向角散射，SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可以提供有关细胞内精细结构及颗粒性质的信息 利用这两个参数可以对细胞进行分群，通过设门就可以将具有一定SSC和FSC的细胞群从大量细胞中区分出来。根据FSC/SSC，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样本中找出血小板和红细胞等细胞群体。2.荧光信号： 有两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的特异荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。测量荧光信号的主要参数： （1）荧光信号的线性测量和对数测量模式 （2 ）细胞高度、面积和宽度的荧光信号测量 （3）光谱重叠的校正(调节荧光补偿电压)，FL1、FL2、FL3是来自于同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。 （1）荧光信号线性测量和对数测量模式线性测量：适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA、RNA、总蛋白含量的测量。 对数测量：在免疫学测量中常使用对数测量。 细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。（2 ）荧光信号的高度、面积和宽度 荧光信号的高度（如FL2-H ）是对细胞高度的荧光信号的测量。一般细胞表达采用H检测，因为细胞高度的荧光信号虽有差异，但不影响阴性群和阳性群细胞在各区域的分布，从而通过统计学（正态分布）得到它们各自分布在不同区域的百分含量。荧光信号的面积 一般对DNA倍体测量时采用面积（如FL2-A），这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反应DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的二个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的，而经过对荧光信号面积积分后，所得到的信号值就相等。荧光信号的宽度宽度（如FL2-W ）常用来区分双联体细胞，由于DNA样本极容易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2期细胞相等，这样得到的测量数据G2期细胞比例会增高，影响测量准确性。 通过设“门”排除双联体细胞，其原理是双联体细 胞所得到的荧光信号（FL2-W ）比单个G2期细胞大，设“门”后得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期。数据处理： 直方图：显示一个参数与细胞之间的关系。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位