CTAB配方及植物DNA提取方法.doc

主要试剂的配制参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下94：（1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03105Pa下高压灭菌20 min。（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。（4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。（5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4.8和6.5)：分别称取KAc晶体49.07 g，溶于80mL的双蒸水，再用冰乙酸调至pH 4.8和6.5，加双蒸水定容到100 mL，在1.03105Pa下灭菌20 min。4保存。（7）3 mo1/L NaAc3H2O溶液(pH 5.2)：称取NaAc晶体20.412 g溶解于约30 mL的双蒸水，用冰乙酸调至pH 5.2，加双蒸水定容到50 mL，高压灭菌20 min。4保存。（8）提取缓冲液（0.4 mol/L葡萄糖，3%PVP，2-巯基乙醇）250 mL：称取葡萄糖19.817 g、PVP 7.50 g，加水溶解并定容到250 mL，在1.03105Pa下灭菌20 min，-巯基乙醇现用现加。4保存。（9）裂解缓冲液（3%CTAB；100 mmo1/L Tris-HC1，pH 8.0；20 mmo1/LEDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2-巯基乙醇）100 mL： 取10%CTAB 30 mL，加1mol/LTrisHC1(pH 8.0)10 mL，加0.5 mo1/L EDTA(pH8.0)4 mL，加5 mol/LNaCl 28 mL并定容到100 mL，高压灭菌20 min，-巯基乙醇现用现加。（11）TE缓冲液(10 mmo1/LTris-HC1，pH 8.0；1 mmo1/L EDTA，pH 8.0)：取Tris-HCl溶液(pH 8.0)1 mL，EDTA(pH 8.0)0.2 mL，用双蒸水定容到100 mL，高压灭菌20 min。4保存。（12）电泳缓冲液TAE（Tris-乙酸）的配制50TAE母液的配制：242.0 g Tris-Bace、57.1 mL冰乙酸、100 ml 0.5mo1/L EDTA(pH 8.0)，用双蒸水空容至1000 mL。1TAE电泳缓冲液的配制：取50TAE 10 mL，再加入490 mL双蒸水，定容至500mL方法丝瓜DNA的提取与纯化CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从预处理过的丝瓜叶片中取出一到两片，做好标记备用：（1）称取1.5 g丝瓜预处理过的嫩叶片于预冷研钵中，置于液氮中，迅速研磨三到四次成粉末状。（2）将粉末状材料转入10 mL的灭菌离心管中，立即加入3 mL 65预热的裂解缓冲液和60L的-巯基乙醇，充分混匀，在65水浴中保温45 min间摇动离心管三到四次)。（3）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（V/V/V=25/24/1），轻轻颠倒离心管匀，上部呈乳状液为止，室温下12000 r.min-1离心10 min。（4）取上清液至10 mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异（V/V=24/1），轻轻颠倒离心管，混匀，室温下12 000 r.min-1离心10 min。（5）把上清液转移到10 mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于-20C预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20静置30 min。（6）4下8000 r.min-1离心5 min，收集沉淀。倾去上清液，用75%（的乙醇漂洗沉淀2次（每次1 mL），将离心管倒置在吸水纸上，风干。（7）沉淀用50L TE缓冲液溶解，并加入0.5L 10 mg/mL RNase，使RNA酶的终浓度为10g/mL，轻轻混匀，于37水浴中温浴4560 min。（8）在离心管加入TE缓冲液300L，再用等体积的氯仿/异戊醇(V/V=24/1)抽提，轻缓颠倒混匀，于4下12000 r.min-1离心10 min。（9）取上相，加入1/10体积的3 mo1/L NaAc（pH 5.2)，轻轻混匀，再加入2.5倍体积并于-20预冷的无水乙醇，混匀，于-20静置30 min。（10）4下8000 r.min-1离心5 min，收集沉淀。倾去上清液，用75%乙醇漂洗沉淀2次（每次1 mL），真空抽干。（11）真空抽干之后将DNA溶100 ul TE溶液再加入1 uL Rnase(10mg/L)，并于37保温30 min，-20保存备用。丝瓜基因组DNA浓度和纯度的测定从提取的DNA样品中取出1L，用TE稀释到100L，然后用UV-1810型紫外/可见分光光度计，分别测定260 nm和280 nm的吸光值OD260和OD280，计算检测DNA的纯度、浓度和产率。DNA纯度OD260/OD280；DNA浓度（ng/L）OD26050g/mL100倍DNA产率（ng/gFW）OD26050g/mL100倍50L/0.5 g丝瓜基因组DNA的电泳检测采用1TAE电泳缓冲液的配制1.5%的琼脂糖凝胶，充分凝结之后，电泳检测提取的DNA完整性。取5L DNA溶液与1L 6Loadingbuffer（溴酚蓝）充分混合均匀后点样，在电压120 V、电流300 A下电泳45 min，溴化乙锭（EB）染色15 min，凝胶成像系统拍照保存，备份原始数据。主要溶液如下：1） 1MTris-HC1（pH 8.0）：在800mL水中溶解121g Tris碱，用浓HC1调节pH至所需值pH 8.0（约42mL HC1），加水定容1000mL，分装后高压灭菌。2） 0.5MEDTA（pH 8.0）：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTANa22H2O），搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0（约10g NaOH颗粒），定容至500mL，高压灭菌。3） 5 MNaCl：称取292.2 g NaCl，用双蒸水定容到1000mL，高压灭菌备用。4） TE缓冲液（pH 8.0）：10mM Tris-HC1（pH 8.0），1.0mM EDTA（pH 8.0）。5） 2CTAB提取液（pH 8.0）：2（w/v）CTAB，1.4 M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HC1，0.2%巯基乙醇（v/v）。即称取CTAB 2 g，加蒸馏水40mL，加1 M Tris-HCl（pH 8.0）10mL、0.5 M EDTA（pH 8.0）4mL和5 M NaCl 28mL，待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100mL。CTAB提取DNA缓冲液配方CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。 TE缓冲液配方TE的组成浓度为：10mM Tris-HCl ；1mM EDTA PH=8.0，配制过程如下：量取下列溶液于500ml烧杯中 1M Tris-HCl Buffer PH=8. 0 5ml 0.5M EDTA PH=8.0 1ml 向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.试剂：Tris-base、浓HC1、EDTANa22H2O、NaOH、NaCl、CTAB、巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、RNase、75%乙醇、冰乙酸1MTris-HC1（pH 8.0）：在800mL水中溶解121g Tris-base，用浓HC1调节pH至所需值pH 8.0（约42mL HC1），加水定容1000mL，分装后高压灭菌。0.5MEDTA（pH 8.0）：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTANa22H2O），搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0（约10g NaOH颗粒），定容至500mL，高压灭菌。5 MNaCl：称取292.2 g NaCl，用双蒸水定容到1000mL，高压灭菌备用。TE缓冲液（pH 8.0）：10mM Tris-HC1（pH 8.0），1.0mM EDTA（pH 8.0）。2CTAB提取液（pH 8.0）：2（w/v）CTAB，1.4 M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HC1，0.2%巯基乙醇（v/v）。即称取CTAB 2 g，加蒸馏水40mL，加1 M Tris-HCl（pH 8.0）10mL、0.5 M EDTA（pH 8.0）4mL和5 M NaCl 28mL，待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100mL。电泳缓冲液TAE（Tris-乙酸）：50TAE母液的配制：242.0 g Tris-Bace、57.1 mL冰乙酸、100 ml 0.5mo1/L EDTA(pH 8.0)，用双蒸水空容至1000