苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠肠粘膜细胞因子和自由基的影响.doc

苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠肠粘膜细胞因子和自由基的影响 熊永爱1 赵强强1 王淼1 黄勤挽1谢兴亮1 杨明*1（1成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室 四川成都611137）摘要 目的 探究苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠肠粘膜细胞因子和自由基的影响机制。方法 利用三硝基苯磺酸（TNBS）复制大鼠溃疡性结肠炎模型，灌胃给予苦参碱溶液进行治疗。治疗结束后，剖取结肠，检测溃疡性结肠粘膜细胞中IL-1、TNF-、IL-4、IL-10等一系列细胞因子的水平；检测结肠粘膜细胞中SOD、MDA水平。另取部分结肠做组织显微镜检查，并对组织损伤评分进行数理统计。结果 1)与模型组相比，苦参碱和柳氮磺胺吡啶均能极显著降低IL-1水平(p0.01)；显著降低TNF-水平(p0.01)；极显著降低IL-4水平(p0.01)；极显著降低IL-10水平（p0.01）；2）与模型组相比，苦参碱和柳氮磺胺吡啶均能极显著升高结肠粘膜细胞SOD水平(P0.01)；极显著降低MDA水平(P0.01)；3）苦参碱和柳氮磺胺吡啶均能促进溃疡面愈合，减少病灶部位炎细胞浸润，水肿及纤维化。结论 苦参碱能明显抵抗溃疡性结肠炎炎性反应，增强机体免疫，通过调节肠粘膜细胞因子失衡和抑制粘膜细胞氧自由基的产生和抗氧化功能干预了UC发病过程。 关键词 苦参碱 溃疡性结肠炎 肠粘膜 细胞因子 自由基 机制Abstract Objective This study is to investigate the effect of matrine on the mechanism of cytokines and free radical in UC rats intestinal mucosa. Methods We made the model of ulcerative colitis by TNBS, and used the matrine to treat animals. After the treatment, animals were killed and colons were taken out, a series of cytokines IL-1, TNF-, IL -4, IL-10 were detected; The SOD and the MDA were detected too. Other colons were tanken to be done the microscopy, and tissue injury scores were caculated. Result 1)Compared with model group, matrine and sulfasalazine could significantly reduce the IL-1 levels (p0.01); significantly decrease TNF- levels (p0.01); significantly reduce IL-4 levels (p0.01); significantly reduce IL-10 levels (p 0.01); 2) Compared with model group, matrine and sulfasalazine could significantly increase the level of SOD in colon mucosa cells (p 0.01); could significantly decrease MDA levels (p 2处溃疡伴炎症/伴炎症1cm 5溃疡/伴炎症2cm，病变增加1cm加1分 6-82.4 统计方法 数据采用组间对照t检验，以s表示。2.5 实验结果2.5.1 苦参碱对结肠细胞内IL-1和TNF-的影响与模型组相比，给药组结肠组织IL-1水平均极显著降低（p0.01），表明柳氮磺胺吡啶和苦参碱均能下调炎性细胞分泌IL-1；给药组结肠组织TNF-水平均显著降低（p0.01），表明两组药物能下调炎性细胞分泌TNF-水平。IL-1和TNF-测试结果见表-2。 表-2 结肠组织TNF-、IL-1水平测定结果(s，n=10) 组 别IL-1(pgmg-1) TNF-(pgmg-1)正常组 60.00 9.97 * 61.44 18.77 *模型组 627.14 209.04 109.33 35.49 阳性组 133.30 39.39 * 77.56 13.05 *苦参碱组 268.89 102.50 * 84.88 12.56 * 注： 与模型组比较，*:P0.01，*:P0.05；与柳氮磺胺吡啶组比较，P0.01，P0.052.5.2苦参碱对结肠细胞中IL-4、IL-10的影响 与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中IL-4、IL-10水平均极显著性升高（p0.01），表明结肠组织局部免疫细胞分泌抗炎因子十分活跃。与模型组相比，苦参碱组、柳氮磺胺吡啶组结肠组织中IL-4水平均显著降低，苦参碱组具有显著性（p0.01），表明苦参碱和柳氮磺胺吡啶都能明显下调结肠组织异常升高的IL-4水平。与模型组相比，苦参碱组、柳氮磺胺吡啶组能显著降低结肠组织中IL-10水平（p0.01），表明各药物都能明显下调结肠组织异常升高的IL-10水平。IL-4和IL-10测试结果见表-3。表-3 结肠组织中IL-4、IL-10水平测定结果(s，n=10) 组 别 IL-4(pgmg-1) IL-10(pgmg-1)正常组 8.91 2.36 * 164.68 55.37 *模型组 14.27 5.46 297.00 94.97 阳性组 9.82 2.17 * 199.25 62.69 *苦参碱组 8.81 1.69 * 159.86 24.55 * 注： 与模型组比较，*:P0.01，*:P0.05；与柳氮磺胺吡啶组比较，P0.01，P0.052.5.3苦参碱对结肠细胞中SOD、MDA的影响 与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中SOD极显著性降低，MDA水平极显著性升高（p0.01），表明结肠组织局部自由基系统处于失衡状态。与模型组相比，苦参碱组、柳氮磺胺吡啶组结肠组织中SOD水平极显著性升高（p0.01），苦参碱能明显上调结肠组织异常降低的SOD水平。与模型组相比，苦参碱组、柳氮磺胺吡啶组结肠组织中MDA水平均极显著降低（p0.01），苦参碱能明显下调结肠组织异常升高的MDA水平。SOD和MDA测试结果见表-4。 表-4 大鼠结肠组织SOD、MDA水平测定结果(S，n=10) 组 别 SOD（Umg-1） MDA （pgmg-1）正常组 38.93 9.34 *0.94 0.23 *模型组17.61 4.452.89 1.47 阳性组 30.88 6.60 *1.15 0.14 *苦参碱组 28.72 7.75 *1.51 0.44 * 注： 与模型组比较，*:P0.01，*:P0.05；与柳氮磺胺吡啶组比较，P0.01，P0.052.4.4 光镜观察 模型组光镜下可见溃疡，病变主要在粘膜下层，组织水肿明显及大量炎性细胞浸润，以淋巴滤泡增生为主，图见B和C。苦参碱组和柳氮磺胺吡啶组溃疡较少并可见已愈合的溃疡组织，组织水肿和充血明显减轻，炎细胞浸润明显减少，图见D和E。镜检评分结果比较见表-5。 A 正常组 B-模型组 C-模型组 D-苦参碱组 E-柳氮磺胺吡啶组 结肠病理切片100倍 表-5 结肠显微镜检查评分(S，n=10) 组 别 镜检评分正常组0.00000.0000*模型组3.91611.5009阳性组2.18291.5888*苦参碱组1.48222.4404* 注： 与模型组比较，*:P0.01，*:P0.053. 讨论 本实验采用TNBS诱导大鼠产生溃疡性结肠炎模型，探讨了苦参碱对实验性溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜细胞因子和自由基的影响。TNBS诱导的溃疡性结肠炎呈慢性变化，病程较长，各种炎症介质如PGE2、TNB2、LTC4和IL等发生明显变化，MPO含量增高，与人类溃疡性结肠炎相似8。 细胞因子在UC发病中的作用已得到公认，肿瘤坏死因子(TNF-)是目前已知的与炎症性肠病(IBD)发病关系最为密切的细胞因子。TNF-主要通过使中性粒细胞聚集、上调凝血酶原效应等参与UC的发病，在IBD患者的血、粪便和肠组织中水平均有所增加9。UC发病过程中促炎因子IL-1、TNF-和抗炎因子IL-4、IL-10等分泌失衡，苦参碱可以明显降低粘膜细胞过表达的细胞因子水平，表明苦参碱抗溃疡性结肠炎与其调节细胞因子失衡有关； 氧自由基在溃疡性结肠炎中发挥了重要的作用。氧自由基是促进炎症发生发展的重要因素，SOD可加速清除炎症反应所产生的对结肠黏膜有损伤的大量超氧化物离子等自由基增强组织细胞的抗氧化能力，显著地减轻结肠黏膜炎症，促进溃疡愈合10。UC发生时，结肠黏膜组织中SOD活力明显下降，MDA含量明显增高，本实验中苦参碱可明显升高SOD活力，降低MDA含量，说明苦参碱通过抑制氧自由基反应干预了UC发病过程，为临床应用提供了理论依据。 参考文献 1 Hanauer SB. Medical therapy of ulcerative colitis. Lancet 2005; 342: 412-4172Fan H, Chen R, Shen L, Lv J, Xiong P, Shou ZZhuang X. Oxymatrine improves TNBS-induced colitis in rats by inhibiting the expression of NF-kappaB p65. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 2008; 28: 415-4203Grottrup Wolfers E, Moeller J, Karbach U, et al.Elevated cell-associated levels of interleukin1 and interleukin-6 in inflamed mucosa of inflammatory bowel disease. Eur J Cli Invest, 2006; 261154Mulden TPJ,Verspaget HW, JanssensAR, et al. Decrease in two intestinal copperzinc containing proteins with antioxidant function in inflammatory bowel disease. Gut, 2009; 32:11465 Heng fan, Xiong Zhuang, Xue-Yun Duan, Li Liang,Yi Liao, Qing Tang .Therapeutic effects of colonic coated compound lightyellow sophora root capsules in patients with ulcerative colitis and mechanisms underlying such effectsJ. World Journal of Gastroenterology.2009,17: 2429-24326刘梅,刘学英.苦参碱药理学研究J.中国中药杂志.2007;26:35-387陈奇.中药药理研究思路与方法M.2003,436-444 8黄永连,张云德溃疡性结肠炎机理研究.中国肛肠杂志.1997,(1):39崔淑兰,唐斌,王万梅.溃疡性结肠炎病人血液中 TNF-和IL-8的临床研究. 世界胃肠病学杂志.2004,11:23-2610 Simmonds NJ，Ramp