EZNA 质粒提取经验和步骤.doc

自己的实验刚刚开始，又涉及到质粒的提取。翻译了OMEGA 的大/小规模质粒提取试剂盒的说明书（D6922-01和D6942-01）。希望能给和我一样的新手一点帮助，同时请大家指正多给建议，特别是自己的心得啊。全是自己打的，帮顶让大家都能下啊E.Z.N.A Plasmid Miniprep Protocol 质粒小规模提取试剂盒Product Number D6942 and D6943,D6944注意：1使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液. 4保存2加60ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中.室温保存除试剂盒外还需准备：可达到10000g的离心机无核酸酶的离心管无菌去离子水或TE缓冲液纯乙醇操作规程：(提取过程在室温下进行)：1在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml （师兄说是5到7ml） (培养基LB（含氨苄青霉素50g/ml），37c振荡培养12-16h。需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5和JM109.2取1.55ml菌液室温10000g离心1min3去上清，加250l溶液（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。4加入250l溶液，温和颠倒离心管46次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。(储存溶液应拧紧瓶盖)5加350l溶液，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000g离心10min.6特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱7弃滤过液，加500l Buffer HB，10000g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略8弃滤过液，再用100%乙醇稀释的750l Wash Buffer清洗吸收柱，10000g离心1min注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签如果经过冷冻，用前必须恢复室温9此步可选：再加750l Wash Buffer清洗吸收柱10.必须将吸收柱10000g离心1min确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤。11.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100l(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000g离心5min，一次可洗脱75-80%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）。12. 检测：方法A：分别在260nm和280nm波长下测定20-50倍稀释液的吸光度DNA浓度260nm吸光度50稀释因子g/ml高质粒拷贝数能达到5ml培养液得到25g DNA，如果260nm吸光度/280nm吸光度大于1.8，说明核酸大于90%。方法B：和预知浓度DNA样品（Marker）一起做琼脂糖凝胶/嗅乙啶电泳，对比结果 （通常情况得到的DNA是单体超螺旋，也有少量多联体）E.Z.N.A. Plasmid Maxi Kit (D6922-01)质粒大规模提取试剂盒注意：1使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液. 4保存2加84ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中.室温保存除试剂盒外还需准备：配有浮桶式转头(吊桶式转头)的离心机可达到12000g的高速离心机50ml无菌离心管高速离心管无菌去离子水或TE缓冲液纯乙醇操作规程：(提取过程在室温下进行)1将带有目的质粒的大肠杆菌接种到200500mlLB（含氨苄青霉素50g/ml），14升培养瓶中37震荡培养过夜（12-16h）需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5和JM109.2取500ml菌液装入适当管子(推荐用250ml离心瓶)中，室温下3500-5000g离心10min3小心去上清，用洁净纸巾吸干管壁残留液体。加7.0ml溶液，吹打数次，用旋涡振荡仪充分悬浮沉淀4移入50ml至少可承受12000g的离心管，加7.0ml溶液，轻轻来回翻转混合710次，至澄清裂解液注意：必须室温下孵育510min避免大力混合，以减少对染色体DNA的机械力切割，提高质粒纯度5加10ml溶液，温和倒转数次，至有絮状沉淀形成室温孵育5min并不时混合室温离心10min得到致密的基因组DNA和碎屑团块6特别小心地吸取上清，加到装配好容积50ml离心管的大型吸收柱，上盖，装入吊桶式转头，室温3000-4000g离心5min注意：确保没有搅动沉淀以保证质粒回收率有必要牺牲24ml溶菌产物单次最多加25ml溶菌产物，如果较多，分2次加入可用此管直接重复步骤6注意：接下来的步骤都会用到浮桶式转头(吊桶式转头)离心机（用固定角转头会使提供的50ml离心管变形或破裂）7加50mlHB缓冲液到吸收柱，上盖，室温3000-4000g离心5min（此步为确保除尽剩余蛋白，同时使后面的操作得到的是高纯度DNA）8加10ml用乙醇稀释的DNA Wash Buffer，上盖，室温3000-4000g离心5min，弃掉滤过液注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签 如果经过冷冻，用前必须恢复室温9 此步可选：重复步骤810. 加10ml纯乙醇，室温3000-4000g离心5min，弃掉滤过液11. 将空管上盖3000-4000g离心10min甩干（用移液器去掉甩到离心管中的乙醇）注意：此步必做！残留的乙醇会影响接下来的步骤12. 洗脱DNA之前可用以下方法进行干燥，以得到更干燥的吸收柱（如果没有真空箱/室，可直接执行步骤13）方法A：取出吸收柱，将吸收柱在真室箱/室中15min，执行步骤13方法B：取出吸收柱，在65真空干燥箱或恒温箱中干燥10-15min，执行步骤1313. 将吸收柱放入干净50ml离心管，加1-2ml(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，3500g离心5min，一次可洗脱70%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）建议：洗脱前，如果将吸收柱放入70热水中浸泡2min，会明显提高回收率同时得到高浓度DNA注意：清除在吸收柱内部O形圈边缘的DNA Wash Buffer残留非常重要如果在洗脱前没有真空干燥吸收柱，最后需对质粒DNA进行净化，方法如下：加氯化钠到洗脱液至终浓度200mM，再加0.8体积的异丙醇，旋涡振荡混合，10000g离心10min，用70%乙醇清洗沉淀，10000g离心10min，轻轻倒出上清，短暂风干，用200-500l无菌去离子水或TE缓冲液再悬浮DNA14. 检测：方法A：分别在260nm和280nm波长下测定20-50倍稀释液的吸光度DNA浓度