本科及硕士生化实验考核试卷(总).doc

分光光度法 利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测量其含量的技术标准曲线 通过测定一系列已知组分的标准物质的某种理化性质，通过作图，得到的数值曲线百分吸光系数 一定波长下，当C以g/100ml表示时，溶液浓度为1g/100ml且光程为1cm时所测的吸光度摩尔消光系数 一定波长下，当C以mol/L表示时，溶液浓度为1mol/L 且光程为1cm时所测的吸光度空白管 用与样品相同的一切试剂但不含待测物质制成的用以消除被比色容器，溶剂以及其他试剂吸收单色光所造成的误差的对照组双缩脲反应 双缩脲在碱性溶液中与CuSO4反应生成紫红色化合物比活性 单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位酶活性单位 37C保温15分钟产生1ug酚为一个酶单位米氏常数（Km） 酶的特征性常数，可近视的表示酶对底物的亲和力，为反应速率等于1/2Vmax时的底物浓度迁移率 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度电泳 带电颗粒在电场的作用下向着与其电性相反的电极方向移动电渗 在电场作用下,液体相对于固相支持物会发生相对位 移的现象凝胶层析 混合物随流动相流经固定相的凝胶层析柱时，混合物中各物质因分子量大小不同而被分离层析 利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法分配系数(Kd) 衡量溶质分子被阻滞程度的特征性常数。Kd=（VeVo）/Vo聚丙烯酰胺凝胶浓度（T） 交联剂克数占单体与交联剂总克数的百分数聚丙烯酰胺凝胶交联度（C） 100ml凝胶溶液中单体与交联剂的总克数内水体积（Vi）层析柱中溶胀凝胶颗粒内部所含水相的总体积外水体积（Vo）层析柱中溶胀凝胶颗粒间隙中液体所占体积 即 空隙的总体积洗脱体积（Ve）被分离物质通过层析柱完全被洗脱出来所需要的洗脱液的体积分子筛 凝胶颗粒是一类具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，起到滤过或“筛”的作用等电点 蛋白质溶液处于某一PH时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，成为兼性离子，此时溶液的PH值为该蛋白质的等电点印迹术 将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程血糖 血中葡萄糖浓度 3.896.11mmol/L限制性内切酶 可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶感受态细胞 受体细胞经过特殊处理，细胞膜通透性发生改变，成为能允许载有外源性DNA的载体分子通过的感受态细胞重组子 含有重组DNA分子的转化细胞转化 受体菌直接摄取供体菌游离的DNA获得新的遗传性状的过程转染 转导 以噬菌体为媒介，将供体菌DNA片段转移到受体菌内，使受体菌获得新的遗传性状逆转录 以RNA为模板，由逆转录酶催化四种脱氧核糖核苷酸聚合产生DNA的过程PCR 在模版DNA，引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应碱裂解法 NaOH可溶解细胞，变性DNA与RNA，基于该特性提取质粒DNA的方法质粒DNA 独立于宿主细胞染色体外，能自我复制，稳定遗传的双链环状DNA琼脂糖凝胶电泳 支持物为琼脂或琼脂糖的电泳技术，线性DNA在电场中的迁移率与相对分子质量成正比，相对分子质量越大，受到摩擦力越大，迁移速度越慢。1、简述在DNA和RNA分离与鉴定实验中，0.14molL NaCl、柠檬酸钠、5%SDS、氯仿、异戊醇、95%冷乙醇的主要作用。（5分）0.14molL NaCl：利用溶解度差异分离核糖核蛋白、脱氧核糖核蛋白（核糖核蛋白在0.14molL NaCl中溶解度高、脱氧核糖核蛋白溶解度低）柠檬酸钠：抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解5%SDS：使脱氧核糖核蛋白解聚，DNA和核蛋白分离氯仿：利用溶解度差异分离DNA和蛋白质（蛋白质在其中沉淀，DNA则溶于水相）异戊醇：减少泡沫产生，有助于于分相95%冷乙醇：将DNA析出2、采用两种方法对待测-球蛋白溶液进行蛋白质定量分析。BCA法：标准管为50ml牛血清白蛋白（1.8mg/ml）50ml水2ml BCA工作液，A=0.250测定管为100ml-球蛋白溶液2ml BCA工作液，A0.300紫外分光光度法：标准管为2ml牛血清白蛋白（1.8mg/ml）2ml生理盐水，A0.300 测定管为2ml-球蛋白溶液2ml生理盐水，A0.450 分别计算两种方法测得的-球蛋白溶液的浓度。（3分）C1s=1.8mg/ml A1s=0.250 V1s=50mlC1x= ？ A1x=0.300 V1x=100ml带入公式，自己注意哪个对应哪个？(2) 这两种蛋白质定量方法在对同一管样品定量时，结果有很大的差别。判断哪一种定量方法的实验结果更加准确，说明判断依据。（2分） BCA法更准确紫外分光光度法受其他因素干扰比较大（如核酸），精度差利用的是共轭双键对紫外光的吸收，酪氨酸、色氨酸均能吸收，不同蛋白质这两种氨基酸的含量差别大，因此缺乏特异性1、简述标准曲线的作用及绘制要点。（看大家整理好的那份）作用：1、利用浓度-光密度的直线特性，判断采用方法是否符合Lambert-Beer定律2、做多次平行测定标准曲线，可判断测定过程中操作、仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性3、从绘制曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度4、大批量样品分析是时，可以省略多次计算，直接查阅标准曲线要点：2. 简述SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。（4分）1、 电泳时，当外界条件不变（如电场、电解液等），蛋白质迁移率主要取决于蛋白质的物理性状2、 SDS能破坏蛋白质分子间的非共价键，使蛋白质变性解离，从而降低和消除各种蛋白质间的天然电荷差异3、SDS-PAGE测定蛋白质分子量时，电场强度保持相同情况下，蛋白质迁移率取决于分子量的大小，当蛋白质相对分子量在一定范围内时，蛋白质的迁移率和相对分子质量的对数呈直线关系，符合LogMW=K-bm（LogMW：相对分子质量的对数；K常数；b斜率；m迁移率）4、可将一致相对分子质量的标准蛋白质的迁移率对相对分子质量的对数作图，获得一条标准曲线，未至蛋白质在相同条件下进行电泳根据迁移率即可在标准曲线上求得相对分子质量。3. 取2ml肝匀浆(1g肝/2ml匀浆)分离DNA和RNA，（1）得到的纯化DNA沉淀，加0.01M NaOH 2.0ml溶解，从中取0.1ml+2.9ml0.01M NaOH稀释，用紫外分光光度法测得A260=0.460,A2800.240,鉴定纯度，计算DNA浓度(g/L)和每克肝组织中提取的DNA量（g/g）。已知K(p)DNA=0.02ml/(gcm)（2）得到的RNA沉淀加蒸馏水2ml溶解，从中取0.1ml+3.9ml蒸馏水稀释，用紫外分光光度法测得A260=0.241,A280=0.139,鉴定纯度，计算RNA浓度(g/L)和每克肝组织中提取的RNA量（g/g）。已知K(p)RNA=0.025ml/(gcm)。（5分）（有点超纲）DNA=A260 *50 * n/1000（ug/ul）RNA=A260*40*n/1000（ug/ul） n为稀释倍数1. 试述从兔子肝脏中分离DNA的原理。（5分）（看课本79）1、利用核糖核蛋白在0.14molL NaCl溶解度高，脱氧核糖核蛋白溶解度低，可将核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白二者分开来。2. 简述影响蛋白质电泳的因素。（5分）（课本34页）1、带电颗粒的物理性状（带电颗粒电荷数、颗粒大小、形状、空间构型）2、支持物的介质（吸附作用、电渗作用、分子筛）3、缓冲溶液（PH、离子强度）4、电场强度3在双缩脲法测定蛋白质含量时，将2.0ml待测血清加生理盐水8.0ml稀释成待测样本，然后按下表操作： 空白管 标准管 待测管蛋白质标准液（ml） / 0.6 /生理盐水（ml） 1.0 0.4 /待测样本（ml） / / 1.0 双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0显色后540nm波长比色，ODs0.382，ODx0.426，已知蛋白质标准液浓度为20 mg/ml ，试求待测血清的蛋白质浓度（g/L）。（4分）Cs=20mg/ml As=0.382 Vs= 0.6 mlCx= ？ Ax=0.426 Vx=1ml记得这题（将2.0ml待测血清加生理盐水8.0ml）稀释了5倍，记得乘回来1. 简述分光光度法原理。（5分）原理：利用不同物质对某个波长的光具有选择性吸收的特性和Lambert-beer定律:A=Ecl,其中，E为消光系数（在一定温度下，对同一物质和一定波长的入射光而言，为常数）c为待测物质浓度，l为光束透过溶液的距离，可以通过待测物质的最大吸收波长对其鉴定，或利用待测物质在某波长下的吸光度得到其浓度。须注意的是，吸光度A或光密度OD或消光度E=-lgT.其中T为透光度。单色光透过溶液时，除了被待测物质，也被比色容器与试剂溶剂吸收，所以必须使用含有与样本相同的一切试剂但不含待测物质的空白管来消除此影响。 3. 用紫外分光光度法测定牛血清白蛋白含量时，准确吸取牛血清0.1ml，加生理盐水9.9ml。稀释成待测样本，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值，A2800.454，A260=0.250,求牛血清白蛋白浓度（g/L）。已知牛血清白蛋白百分吸光系数6.3（100ml/(gcm)）。（4分）OD280/OD2601.5,样本蛋白质含量（mg/ml）=OD280/k*10（k=）记得这道题有稀释100倍（吸取牛血清0.1ml，加生理盐水9.9ml）答案：72mg/ml1. 简述分光光度法的波长选择的原则。（5分）（看书本第9页）2. 简述双缩脲法和紫外法测定蛋白质浓度的原理及优缺点。（5分）紫外：蛋白质分子中有含共轭双键的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，可以吸收紫外光，吸收峰在280nm处，且再此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。优缺点：1、操作简单快速、样品稀释后倒入比色杯即可，2、样品不损失，测定后可回收，多用于纯化蛋白质的微量测定。但，精确度差，核酸等其他物质在同一紫外区也有吸收且不同蛋白质中芳香族氨基酸的含量变动大。故，若要或者较为准确数值，需测OD260OD280后根据经验公式调整或有待测蛋白质的纯品做比较或知其消光系数。双缩脲法： 双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，而蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应生成紫红色化合物。在一定范围内，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。故可测定蛋白质浓度优缺点：操作简便，迅速，受蛋白质种类性质影响较小，但，灵敏度不高，特异性不高，除肽键外，其余基团也可反应 3在凝交通透层析（葡聚糖G50）中，蓝葡聚糖2000洗脱体积为8.2ml，细胞色素C的洗脱体积为14ml，DNFP甘氨酸的洗脱体积为18.2ml,试计算该层析柱的内、外水体积及细胞色素C的分配系数。（4分）看一下分析化学1、 加水：隔绝空气的氧，使胶面平整2、 甘氨酸：氯离子电泳时移动最快，后面形成离子浓度低的电导区，低电导区形成高电压梯度，带动中间的蛋白质和最慢的甘氨酸离子移动，甘氨酸有助于蛋白质浓缩成一薄