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动物科技学院 脂肪间充质干细胞 杨公社 Adipose derivedMesenchymalStemCells 汇报提纲 研究背景脂肪干细胞优点及表面标记多向分化潜能猪脂肪干细胞分离培养 诱导分化及其建系应用前景及待解决的问题 一 研究背景 动物体内 脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和赋形组织 还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细胞因子的重要部位 脂肪细胞增殖与分化失常是导致肥胖及 型糖尿病的重要因素 因此 脂肪细胞分化的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之一 干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞 目前的成体干细胞主要是骨髓来源的间充质干细胞 胚胎干细胞因道德伦理问题限制了其应用 骨髓来源的间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞 但骨髓穿刺给病人带来的痛苦大 且只能得到少量细胞 大约1个间充质干细胞 105基质支持细胞 因而存在取材困难 病人不易接受的缺点 因此 国内外研究人员积极寻找可替代的干细胞来源 背景知识 2001年Zuk等首次从病人脂肪组织悬液中分离获得了有多向分化能力的细胞 并将其命名为抽脂处理细胞 PLA PLA在特异性诱导剂下可分化为成骨细胞 软骨细胞 脂肪细胞和成肌细胞 之后 多个研究小组相继证实 脂肪组织中确实存在着与骨髓间充质干细胞相似的成体干细胞 脂肪间充质干细胞的发现进一步拓宽了脂肪组织领域的研究 背景知识 二 脂肪源间充质干细胞的优点 首先 从人类医学角度说 获取脂肪间充质干细胞比骨髓源性干细胞容易的多 皮下脂肪切除术是一种普通的外科手术 其安全性高 对患者带来的痛苦小 即AMSCs具有易获得性 安全 可迅速扩增及多向分化能力等特点 其将成为具有广阔治疗应用前景的一类成体干细胞 其次 脂肪组织比骨髓中所含干细胞比率大 通过成纤维细胞集落形成单位比较脂肪组织显示 成人骨髓来源细胞中成纤维细胞集落形成单位出现频率为1 50000 1 1000000 而当脂肪组织用胶原酶消化 除去上层漂浮的成熟脂肪细胞 下层细胞中成纤维细胞集落形成单位的频率为1 100 说明脂肪组织中干细胞数目至少是骨髓的500多倍 脂肪间充质干细胞优点 最后 从经济和社会效益看 从脂肪组织中获取干细胞可将原本认为是废弃物的脂肪 如临床上脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后不可实用的内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源 具有极大的经济与社会效益 脂肪间充质干细胞优点 关于脂肪间充质干细胞标志 目前尚无统一标准 一般认为 脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均表达CD44 CD105 STRO 1 CD166及CD117 其中CD117是一种干细胞因子受体 在全能或多能干细胞中表达 包括胚胎干细胞 表面标记 除了上述几种标记外 脂肪间充质干细胞也表达其他多种分子标记 包括CD29 1 整合素 在血管发生治疗中起重要作用 CD44 透明质酸盐 和CD49e 5 整合素 在细胞粘附纤连蛋白中起重要作用 等 表面标记 不同研究组对脂肪间充质干细胞表面标记的鉴定结果并不完全一致 如Gronthos等发现AMSCs不表达STRO 1 但Zuk等发现表达STRO 1 这些不一致的结果可能与细胞所处状态及纯度有关 表面标记 表面标记 近几年的研究结果表明 在合适诱导剂下 脂肪间充质干细胞和骨髓干细胞一样 可向脂肪 软骨 成骨 神经元细胞 成肌细胞 血管内皮细胞等方向分化 三 多向分化潜能 多向分化潜能 StremBM 2005 多向分化潜能 脂肪间充质干细胞向不同细胞分化是在特异性诱导因子作用下进行的 下面介绍常用的一些多向诱导分化因子及诱导后的细胞特性 多向分化潜能 肝实质细胞在2006年4月第16卷4期的自然科学进展上 裴雪涛等人发表的文章 人脂肪来源的干细胞体外培养特性及分化为肝细胞样细胞的研究 脂肪源性干细胞的分离因物种不同消化方法不同 本实验室采用型胶原酶消化法分离获得猪脂肪源干细胞 表达脂肪干细胞表面标记 在合适诱导剂下 这些细胞分化成了成骨细胞 成肌细胞和脂肪细胞 在此作一简单介绍 四 猪AMSCs的培养及诱导分化 细胞培养7 8天后 细胞生长即可达80 90 融合 贴壁细胞紧密排列成漩涡状 网状 辐射状 有一定的方向性 集落大小不一 含数个至数百个细胞不等 集落中细胞形态为典型梭形细胞 图A 这就是我们所要分离获得的猪AMSCs 原代培养14d左右即可形成致密单层 图B B A AMSCs的培养特性 CD44 50 CD105 100 CD14 50 CD34 100 CD106 100 HLA DR 50 利用免疫组织化学方法检测猪AMSCs特异性表面标记 结果 CD44和CD105呈阳性 CD14 CD34 CD106 HLA DR均为阴性 AMSCs的表面标记 在地塞米松 抗坏血酸和 磷酸甘油钠的诱导作用下 猪脂肪间充质干细胞逐渐由成纤维样的长梭形 对照组 图A 变为成骨样的方块形 细胞堆积呈卵圆形或方形 图B 成骨诱导 成骨诱导后的形态学观察 B 茜素红染色检测诱导细胞的矿物质沉积状况 结果 猪脂肪间充质干细胞在成骨诱导第7天开始出现小的点状钙化斑 A 诱导第14天形成广泛的钙化结节 B 诱导21天钙化结节更加明显连接成片 C D为对照组 成骨诱导 RT PCR检测成骨标志基因COL 1 型骨胶原 及OCN 骨钙素 表达M marker 1 4分别为第0天 7天 14天 21天OCN的表达 5 8为COL 1的表达 结果 在成骨诱导分化的早期 第7天 可检测到成骨特异性基因 型骨胶原和骨钙素的表达 随着诱导时间的增加 2个基因的表达量呈上升趋势 成骨诱导 RT PCR检测标志基因mRNA的表达 上述结果说明 在合适诱导剂下 猪脂肪间充质干细胞形态和排列均发生变化 成纤维样的长梭形变为成骨样的方块形 细胞堆积呈卵圆形或方形 茜素红染色和RT PCR均表明可以诱导分化成骨细胞 成骨诱导 成肌诱导第7天出现细胞球形变化 A 诱导第14天开始出现接触 融合 部分出现伪足 形态变长 B 诱导第21天周围梭形细胞明显减少 形成巨大的球形细胞 C D 上图为茜素红染色 成肌诱导 成肌诱导后的形态学观察 成肌诱导后肌红蛋白 myoglobin 免疫荧光染色 成肌诱导第14天 可检测到肌红蛋白 myoglobin 的表达 图A 第21天表达明显增加 图B 成肌诱导 免疫荧光染色 actin399bpMyoD243bpMyf5154bp 上图是用5 氮杂胞苷诱导1周后的结果 由图可以看出 诱导一周后即可检测到成肌细胞分化早期表达基因Myf5和MyoD的表达 RT PCR检测成肌标志基因的表达1为对照 2为Myf5 成肌调节因子 3为MyoD 生肌决定因子 成肌诱导 肌细胞标志基因mRNA的表达 成脂诱导后的形态学观察 诱导48h 100 诱导21d 100 对照21d 100 脂滴融合 200 猪脂肪间充质干细胞经成脂诱导48h后 细胞胞浆内出现个别脂滴 图A 随着诱导时间的延长 充脂细胞数量增加 图B 且小脂滴逐渐融合成大脂滴 图C 对照组细胞无充脂细胞出现 图C 成脂诱导 油红O染色 B 诱导后的脂肪细胞经油红O染色后 脂滴呈红色 成脂诱导 脂肪细胞标志基因表达 B AMSCs成脂诱导后第2天可以检测到脂肪细胞标志基因PPAR 的表达 且随着诱导时间的增加 其表达水平也增加 PPAR 595bp actin399bp 成脂诱导 由上述结果可以看出 猪脂肪间充质干细胞在地塞米松 胰岛素 吲哚美辛等的诱导作用下 细胞形态发生变化 由长梭形变为充满脂滴的脂肪细胞 油红O染色和RT PCR均表明可以诱导分化脂肪细胞 成脂诱导 研究表明 脂肪细胞由中胚层间充质干细胞发育而来 近30多年来对脂肪细胞的研究主要使用的是鼠源性前体脂肪细胞系和原代前体脂肪细胞 但是这两者都是已经定向的单能细胞 只能分化为成熟的脂肪细胞 因此这两个体外培养体系的研究只能局限于前体脂肪分化为成熟脂肪细胞这一阶段的细胞和分子事件 猪AMSC细胞系建立的初步研究 因此 AMSCs细胞系的建立可为研究脂肪细胞分化全过程 探讨脂肪细胞分化早期细胞与分子事件提供新的研究模型 本实验室在成功分离猪原代AMSC细胞后 细胞单克隆扩增方法获得单一来源的AMSC细胞 传20代后细胞形态一致 经鉴定仍然具有AMSC表面标志 细胞单克隆扩增培养 所有细胞均来源于同一祖细胞 细胞形态一致 CD105 CD44 24代细胞表面marker鉴定 目前我们正在对保存的细胞进行染色体核型分析 支元体检测等工作 现有的研究表明 脂肪组织是一个易获取和储量丰富的成体干细胞库 AMSCs取材容易 创伤小 具有可控制的多向分化能力 对于组织工程来说 几乎是个 完美 的细胞 且细胞培养 扩增较容易 易获得大量可供自体或异体移植使用的干细胞 在急 慢性骨 软骨组织损伤 肌组织缺损 矫形手术 中枢神经系统损伤及其它领域有潜在应用价值 五 AMSC应用前景及待解决的问题 但若将该细胞应用于临床 仍需在动物模型上进行大量安全性和有效性的实验 尽管AMSCs实际应用过程中仍存在一些需要解决的问题 如体外培养是一种优化过的环境 而体外培养后的AMSCs能否适应体内环境而继续生长分化 在体内AMSCs分化控制过程中能否排除致瘤性风险及是否发生免疫紊乱等 另外 种子细胞最终移入体内还需有合适的生物材料作载体 这种载体必须具有生物相容性 并可生物降解 易于生长因子等促细胞分化和组织形成的分子物质的连接和输送 易于生产和使用 目前关于生物载体的研究相对较少 因此 特异性组织生物材料也将是一个重要而广阔的研究领域 但相信有关AMSCs的研究仍然前景广阔 脂肪组织来源的AMSCs未来极有可能会取代目前的干细胞源而成为组织工程 基因治疗的一个新的热点 并能解决一系列临床难题而具有良好的应用前景 鉴于脂肪源性干细胞强大的 可塑性 容易获得 免疫排斥小等优点 国外一些公司和研究机构等纷纷谋求脂肪间充质干细胞成为组织工程或细胞治疗新的同种异体种子细胞来源 并申请了相关专利 2004年12月16日MacroPoreBiosurgery公司 法兰克福 与Giessen大学联合对外公布使用脂肪间充质干细胞治疗一名七岁女孩颅骨缺损的临床报告 为该领域今后的工作奠定了基石 通过对欧洲专利局世界专利数据库检索 2005年1月5日前已经公开的关于脂肪源性干细胞的基本专利共有14项 显示出脂肪间充质干细胞潜在的市场价值 总之 随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展 脂肪组织源性干细胞的研究也会更加深入 促进 支持细胞生长分化的各种生物因子 模拟体内微环境的细胞外基质等均将成为研究热点 并将取得重大突破 为脂肪组织源性干细胞成为现代组织工程学研究的理想种子细胞和最终用于以细胞为基