生物显微技术.doc

1. 生物显微技术:介绍光学显微镜和电子显微镜的基本理论知识和样品制备技术的一门专业基础课。2. 显微镜(microscope)是一种借助物理方法产生物体放大影象的仪器。最早发明于16世纪晚期，至今已有400多年的历史。3. 公元前1世纪：通过球形透明物体去观察微小物体时可以使其放大成像。4. 3000多年前，欧洲腓尼基人发明了人造玻璃。5. 约在四百年前:眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有35x （单式显微镜）6. 单式显微镜的缺点:焦距又与放大倍数成反比，而焦距与透镜直径成正比，也就是说，焦距越短，放大倍数越大，而透镜直径又越小。7. 列文虎克和他的显微镜（约1680，300倍左右，直径为2-4毫米、单式显微镜）,一生中制作了200多台显微镜和500多个镜头.他是第一个看到活细胞的人，8. 1590年代荷兰眼镜制造商J.Janssen和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜，尽管其放大倍数不超过10倍，但具有划时代的意义。 9. 复式显微镜在性能上明显优于单式显微镜:一是它的放大率可以做得很高，可以把几个放大倍数较小的凸透镜组合起来获得很高的放大率。二是制造工艺较简单，不必磨制一个个极小的透镜10. 伽利略可能是最早把复式显微镜用于科学研究的人。制造于17世纪晚期 .他用显微镜研究了昆虫，观察了昆虫的运动器官、感觉器官和复眼。11. 列文虎克的显微镜：光源系统:显微系统:由载物台、物镜,调焦螺旋、镜筒、目镜组成. 物镜:一个复合物镜调焦螺旋:这个设计与伽利略显微镜一样目镜:复合目镜在当时也是一种很先进的设计缺点：存在很大的球面像差和色差, 成像质量糟12.十八世纪中使用最广泛的显微镜:卡夫(Cuff)显微镜光学性能：45100倍.它有很严重的色差和球面像差.它的分辨率极低,只有10微米透射观察、落射观察、活体观察13.历史上最豪华的显微镜:英王GeorgeIII的银显微镜: 14.发明消色差物镜的van Deijl, Amici和 Lister. 制造出高质量的光学玻璃的卡尔.蔡司(Carl Zeiss)和德国肖特（Schott ）.设计制造了高度消色差物镜和高分辨率的阿贝物镜的阿贝(Abbe)等等.在十九世纪中叶还出现了显微摄影15.Ladd的学生显微镜 (1864)采用了当时最先进的齿轮调焦装置, 这个显微镜的镜臂上多出了一个在前几个世纪的显微镜上都看不到的东西-聚光镜.16.历史上最精美的显微镜-Wenham的显微镜. （1882）当时最为精巧先进的齿轮传动系统和齿轮调焦系统,聚光系统还有成像系统.它的物镜和目镜的质量在当时都是最高的.这个显微镜的最突出的特点是它的齿轮传动装置.这个显微镜的镜座,镜臂,载物台都可以旋转.17.1886年，德国人Ernst Abbe 发明复消差显微镜，并改进了油浸物镜，至此普通光学显微镜技术基本成熟。分辨率达到极限18. 二十世纪中比较具有代表性的显微镜：JamesSwift 与 Son 的双目解剖显微镜。Bausch 和 Lomb 的解剖显微镜 。Zeiss 实验室显微镜19. 20世纪中叶出现了以短波长、高能量的光线作光源的荧光显微镜和紫外光显微镜20. 1938年，德国工程师恩斯特.卢斯卡制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。21. 1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM），电子显微镜的分辨率达到纳米级别。22. 1983年，宾尼西和罗雷尔发明了扫描隧道显微镜（STM），可将物像放大数亿倍以上，从而使人们第一次直观地“看到了”原子、分子，被人们称为可以“看得见原子”的显微镜 （和卢斯卡一起分享了1986年诺贝尔物理学奖）23. 20世纪80年代 激光扫描共聚焦显微镜开始应用24. 光的直线传播定律：光在均匀介质中沿直线传播。25. 在非均匀介质中光线将因折射而弯曲，这种现象经常发生在大气中，比如海市蜃楼现象，就是由于光线在密度不均匀的大气中折射而引起的。26. 【费马定律】：当一束光线在真空或空气中传播时，由介质1投射到与介质2的分界面上时，在一般情况下将分解成两束光线：反射(reflection)光线和折射(refraction)光线。27. 当光传至二介质的光滑分界面时遵循反射与折射定律。28. 光线的反射取决于物体的表面性质。29. 【反射定律】：1、入射光线、法线和反射光线在同一平面内；2、入射光线与反射光线在法线的两侧；3、反射角等于入射角 30. 光的折射是由于光在不同介质的传播速度不同而引起的。（n1/n2 = v1/v2）31. 【折射定律】1、折射光线与入射光线和法线在同一平面内；2、折射角与入射角的正弦之比与入射角的大小无关，仅由两介质的性质决定，当温度、压力和光线的波长一定时，其比值为一常数，等于前一介质与后一介质的折射率之比n1 sin i = n2 sin r32. 光的衍射：在光的传播过程中，当光线遇到障碍物时，它将偏离直线传播，这就是所谓光的衍射。衍射不仅使物体的几何阴影失去清晰的轮廓，在边缘还会出现一系列明暗相间的亮纹。33. 光的干涉：满足一定条件的两列相干光波相遇叠加，在叠加区域某些点的光振动始终加强，某些点的光振动始终减弱，即在干涉区域内振动强度有稳定的空间分布。34. 凸透镜成像条件：成像条件 成像规律u2f fv2f ，成倒立缩小的实像U2f v2f，倒立等大的实像fu2f v2f，倒立放大的实像uf 不成像uf 物和像在同一侧，成正立放大的虚像u=2f是成放大实像和缩小实像的分界点u=f是成实像和虚像的分界点35. 透镜成像时的象差：色差 球差 慧差 象散 场曲 畸变36. 色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。消除方法：使用单色光（加入滤光片)37. 球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差的矫正常利用透镜组合来消除，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。38. 旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的补偿目镜配合，才能达到纠正效果。一般新型显微镜的球差完全由物镜消除。39. 慧差：由位于主轴外的某一单色轴外物点，以大孔径光束成象，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，而是结成拖着明亮尾巴的慧星形光斑。消除方法：使用轴向平行光 。40. 象散：当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起象散。象散使物点在成象后，形成一个椭圆形的斑点。象散与视场角有关，而与孔径大小无关因此，在广角镜头中象散就比较明显，在拍摄时应尽量使被摄体处于画面的中心。消除方法：通过复杂的透镜组合来消除。41. 场曲：垂直于主轴的平面物体经光学系统所结成的清晰影像，若不在一垂直于主轴的像平面内，而在一以主轴为对称的弯曲表面上，即最佳像面为一曲面，则此光学系统的成像误差称为场曲。当调焦至画面中央处的影像清晰时，画面四周的影像模糊；而当调焦至画面四周处的影像清晰时，画面中央处的影像又开始模糊 42. 研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲 43. 畸变：摄物平面内的主轴外直线，经光学系统成像后变为曲线，则此光学系统的成像误差称为畸变。44. 广角镜常见，畸变是由于透镜的放大率随光束和主轴间所成角度改变而引起45. 畸变只影响影像的几何形状，而不影响影像的清晰度。46. 减小畸变的方法是，对单一透镜改变镜片的外形，采用最佳的外形可以使畸变减小到最小程度；尽量避免使用镜头焦距的最广角端或最远摄端，并使用较小的光圈47. 显微镜的基本构造：光学部件：目镜、物镜、聚光器和光栏 机械部件:镜体、载物台、光源和滤光片、光路转换机构。48. 目镜：惠更斯目镜、冉斯登目镜、补偿目镜、平场目镜、广视场目镜、超广视场目镜、摄影目镜、其它目镜49. 惠更斯目镜（H）：荷兰科学家惠更斯1703年设计两块单面凸透镜片组成。接近眼球的透镜叫接透镜，第二片透镜称场镜（会聚透镜），凸面都朝向物镜一端二者中间装有一个金属环，这既是视场光栏，也是消杂光光栏。优：消除了彗差，像散、价格低，视角大，适用于一般生物显微镜低倍或中倍观察。缺：球差、色差、场曲较大50. MH或HM表示惠更斯目镜的改进型 51. 冉斯登目镜（R，SR）：783年设计两片单凸透镜结构，由凸面相对优：能校正慧差和像散缺：球差、色差略大、视场小目前在生物显微镜中已很少采用这种目镜（但可用于对物镜所成的象进行测量，适用于测微目镜），特别适合于小型望远镜使用。52. 补偿目镜（K，凯尔纳目镜，凯涅尔目镜 ）：是在冉斯登目镜的基础上发展而来，出现于1849年主要改进是将单片的接目镜改为双胶合消色差透镜，大大改善了对色差和边缘像质的改善（高倍时表现欠佳）视场较大配合复消色差物镜（Apo）使用53.平场目镜（P，PL）：其结构自身可以消场曲又叫对称目镜（普罗素目镜；PL；S）：两个双胶合镜有更大的出瞳距离和视场造价更低适用于所有的放大倍率54.Nagler目镜：一种于1979年由美国人设计的高档目镜，有着82度的惊人视场优质的边缘像质舒适的出瞳距离55.常用目镜的放大倍数为516倍 目镜的长度越短，放大倍数越大56.双目型显微镜目镜的镜筒上还装有屈光度调整节环57.物镜的分类按物镜前透镜与盖玻片间的介质（1）干燥系物镜（2）水浸系物镜（3）油浸系物镜（4）甘油浸系物镜按物镜放大率的高低（1）极低倍物镜：放大率 1（2）低倍物镜：放大率在16（3）中倍物镜：放大率在625（4）高倍物镜：放大率在2510058.消色差物镜是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”。只校正黄、绿波区的球差、色差，红光和蓝光的轴向色差，未消除剩余色差和其他波区的球差、色差，并且像场弯曲仍很大，只能得到视场中间范围清晰的像。使用时宜以黄绿光作照明光源，或在光程中插入黄绿色滤光片。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用，经济适用，广泛地应用在中、低倍显微镜上。59.复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样，能校正红、蓝、绿三色光的色差，消除了二级光谱，因此像质很好，色差的校正在可见光的全部波区。若加入蓝色或黄色滤光片效果更佳。同时能校正红，蓝二色光的球差。常用物镜中，性能最好的。通常与补偿目镜配合使用。60.平场消色差物镜(Plan Ach)：Ach基础上能校正像散和像场弯曲平场复消色差物镜（Plan Apo）：除进一步作像场弯曲校正外，其它像差校正程度均与复消色差物镜相同，使映像清晰、平坦；但结构复杂，制造困难。半复消色差物镜（FL）：部分镜片用荧石制成，故又称荧石物镜，能校正红、蓝两色光的球差和色差。在成象质量上，远好于消色差物镜。与补偿目镜配合超平场物镜（Splan）超平场复消色差物镜（Splan Apo）61. 聚光器一般装在载物台的下方，用来得到最好的照明效果，可以弥补光量的不足，适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上。62. 聚光器分类：明视野聚光器：阿贝聚光器、齐明聚光器（质量最好）、摇出聚光器。暗视野聚光器。特殊用途聚光器：（如偏振光、相位差等）63. 阿贝聚光器：组成：1、集光镜（聚光镜） 2、虹彩（孔径光栏） 3、升降螺旋 4、反射镜 （5、滤色镜环）64. 聚光镜由两个或两个以上透镜组成。主要作用是提高视野的亮度和提高接物镜对标本的分辨率。它具有一定值的数值孔径（NA)65. 孔径光栏（阑）虹彩：结构像照相机的光圈，它不但可以调节照明强度，同时还具有改变分辨率和反差的作用。孔径光栏开大，分辨力高，反差弱，孔径光栏缩小则相反。66. 反光镜分为平凹两面，并要使光束正好对准反光镜中央。67. 滤色镜环用来放置滤色片或毛玻璃，可用来改变光色或亮度。68. 光阑（光栏）：广义：指一切限制入射光束截面的框孔，如聚光镜、物镜、目镜、镜筒等。狭义：那些专门限制和调节入射光束的截面、光通量的可变光栏或限制视野范围以及在视野范围内的固定框孔叫做光阑。 （带孔的金属薄片 ）69. 光阑的主要类型：孔径光阑、视场光阑70. 孔径光阑：也称有效光阑，一般安装在聚光器中，决定透过物镜而成像所必需的光束截面的光栏叫孔径光阑，从而决定像照度。71. 视场光阑：限制视场的光阑，决定物平面或物空间有多大范围可以被光学系统成象的光阑。72. 光阑的作用：通过限制光具组的光束孔径和视场，影响着光具组成像质量像差、像的亮暗、景深、分辨本领及空间范围等。 因此要正确使用光阑73. 镜体：镜臂、镜筒、镜座74. 载物台：机械式载物台、数控载物台、保温载物台、滑动式载物台75. 照明装置：灯泡、灯室、滤光片76. 滤光片的种类：灰色系列滤光片：减少视野的亮度、绿色滤光片、黄色滤光片、蓝色滤光片、红色滤光片77. 滤光片使用原则：适当的反差：使用与物体颜色互补的色光滤光片。细微结构要清晰。未染色的物体。78. 显微镜的光学原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。79. 眼睛：明视距离：25cm。极限分辨角约为1。分辨力约为0.073mm 80. 要知道的几个重要的分辨率：人眼：0.073mm（0.2mm）/250mm 光学显微镜：0.2um 电子显微镜：0.2nm81. 显微镜的主要性能参数 ：主要由物镜决定：数值孔径（镜口率）、分辨率、放大率、清晰度、焦点深度、视野、工作距离82. 镜口率（数值孔径；NA；）：NA= n sin u/2n :透镜前透镜与被检物间介质的折射率u :孔径角（镜口角）83. 如何使数值孔径增大？n增大； u增大84. 孔径角最大：小于180，sin u/2小于1可见：数值孔径有极限，不可能无限增大85. NA与分辨力成正比。86. 数值孔径是透镜（物镜和聚光镜）性能最重要的指标。87. 同样放大倍数下，数值孔径越大，物镜的性能越高。88. 干燥系物镜 NA1,最大为1.4（特殊的可达到1.6）90. 聚光镜的数值孔径大小，可通过孔径光阑进行调解，一般为1.2-1.4。也可通过前透镜的装卸来调节。91. 分辨率（分辨距离）：指显微镜能分辨两个物体之间的最小距离。用D表示。D越小，分辨率越高。D=0.61 /NA D：分辨率 :光波的波长 N.A.=镜口率92. 如何提高显微镜的分辨率？ 缩短入射光的波长 （紫外光：小于400nm）使用数值孔径大的物镜（放大倍数大）93. 普通光线的波长为400760nm。因此普通光学显微镜的分辨力极限约为0.2m。94. 放大率（放大倍数）：在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。显微镜下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所决定。95. 有效放大率：M=MobMocMob （物镜放大率） =/F1为标准镜筒长度160毫米；F1为物镜的焦距Moc（目镜放大率） =250/F2250为人的明视距离，单位为毫米；F2为目镜的焦距 注意：这里是指线性放大率96. 放大倍数的合理匹配：在一定的放大倍率下，物镜和目镜可任意组合，但其组合的前提，主要是考虑有效放大率，这是正确使用显微镜的一个重要法则。 也就是说我们不能无限加大物镜和目镜的放大倍数97. 显微镜的有效放大率，为所用物镜数值孔径5001000倍。即物镜和目镜的放大倍数的乘积等于该物镜数值孔径的5001000倍。98. 假如你使用数值孔径为0.65的40X物镜观察标本时，应选多大的目镜与物镜合理匹配呢？首先依据有效放大率求出有效总倍数，再被40除，即为应选择目镜的倍数。计算过程为：0.655000.651000）40816，也就是说：数值孔径为0.65的物镜，应选用816倍的目镜与之匹配99. 如果目镜倍数太低，总放大倍数太小，物镜的分辨率不能充分发挥，本来可以辨认的细节，由于总放大倍数太小，挤在一起难以分辨。而高于16倍的目镜所得放大倍数叫做“空的放大”，对影响细节的分辨，没有丝毫提高，反而清晰的深度小，不能清晰反映不同水平层次的结构。100. 物镜和目镜的合理搭配：1.类别上的匹配：平场物镜，配合平场目镜使用。消色差物镜通常与惠通斯目镜配合。复消色差的物镜通常与补偿目镜配合。 2.放大倍数的匹配101.焦点深度（焦深）：显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的上下两侧也能看清楚，两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。102. 焦深大，可看到被检物体的全层；而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层。103. 视场数：目镜中观察到的物像的一定范围叫视场数视野与总放大率成反比。在同一总放大率下，视野的大小决定于目镜的某些性能。目镜的视场光阑的直径是最主要的条件。视场光阑的直径叫目镜的视场数值目镜的类型104. 计算视场直径（单位mm），是用目镜的视场数除以物镜的放大倍率。105. 工作距离：也叫物距，指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。106. 一般情况下，物镜的数值孔径越大，其工作距离越小。107. 覆盖差：由于盖玻片厚度不标准，而产生的象差，称为覆盖差。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17毫米，允许范围在0.16-0.18毫米。物镜外壳上标刻的0.17，即表明该物镜要求的盖玻片厚度108. 物镜标识：BF： 明场DF： 暗场POL： 偏光DIC： 微分干涉FL： 荧光: 无限远光学系统 0: 无盖玻片109. 热门显微镜：奥林巴斯、江南、蔡司、奥特、麦克奥迪、尼康、蔡康、博冠110. 显微镜的分类:根据光源不同:光学显微镜：以可见光为光源（紫外线显微镜以紫外光） 电子显微镜：以电子束为光源111.光学显微镜的分类:按目镜的数目分：单筒、双筒按观察对象分：生物、金相按物镜朝向分：正置、倒置按照明方法分：透射、反射（落射）从光学放大倍数或合像光路来分：生物显微镜、立体显微镜112.按特种用途来分:倒置显微镜相差显微镜荧光显微镜暗视野显微镜体视显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜激光扫描共聚焦显微镜113. 倒置显微镜:最大特点： 光源和聚光位于载物台的上方，照明光源自上方向下照射；物镜安装在载物台的下方，向上对焦.114. 其他特点:1.物镜、聚光镜及其他光学具组均适用于长焦距观察；由于工作距离的限制，倒置显微镜物镜的最大放大率为60X 2.调焦时，是调节物镜的上下位置，而不是载物台。3.常常与相差物镜配合使用，称为倒置相差显微镜；也可以配其他配件。115. 相差显微镜:可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察活细胞。适合于观察培养瓶中贴壁生长的细胞或浮游于培养液中的细胞，无需对样品进行处理。1935年荷兰人泽尼克（Zernike)提出相差原理。1941年蔡司工厂生产出第一台相差显微镜116. 原理:相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的相位差（即光程差）转化为振幅差（光强差）的特种显微镜。117. 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置，光程)的不同。118. 光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。119. 由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过时，直射光和衍射光的光程就会有差别（合轴后，产生相位差）。120. 光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异。121. 相差显微镜的特殊装置:环状光阑位相板（相位板）、合轴调节望远目镜、.绿色滤光片122. 环状光阑：具有环形开孔的光阑，位于聚光器的前焦点平面上。光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。使用时要把与物镜匹配的光阑转到光路 123. 相位板：位于物镜内部的后焦平面上，带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标志。124. 相位板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉60%93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟1/4波长。125. 根据相位膜和吸收膜的不同喷涂方法，可以使视野中物体出现两种效果：比背景明亮（暗中之明）：负相差（N）（负相差物镜）比背景暗（明中之暗）：正相差（P）（正相差物镜）126.负相差物镜用缩写字母“N”表示，正相差物镜用缩写字母“P”表示由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同，可分为高、中、低及低低，如Olympus光的透过率分为：7%、15%、20%、40%四个等级，因此分为高（H），中（M），低（L）及低低（LL）四类，构成了负高（NH）、负中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四种类型相差物镜127. 合轴调节望远目镜：是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。128. 由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。129. 相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。130. 使用：拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜 旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。 再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。 如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。 如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。 调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。131.绿色滤光片：1、相差物镜多属消色差物镜，这种物镜只纠正了黄、绿光的球差而未纠正红蓝光的球差，在便用时采用绿色滤光片效果最好2、为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光3、绿色建光片有吸热作用（吸收红色光和蓝色光），进行活体观察时比较有利4、人眼对绿光最敏感。132.成像原理和光路：光源通过环状光阑，经聚光器后聚成光束光束通过物体，发生不同程度的偏斜（衍射）未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。共轭面和补偿面分别将两种光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。133. 相差显微镜的使用步骤（1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜，匹配相应的环状光阑。（2）将标本片放到载物台上，调整普通合轴（3）开大光源，用合轴调节望远镜合轴。（4）换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。（5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。（6）若需使用油镜，则在聚光镜前也要滴油。134.注意事项(1)视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大,而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光,物镜相板上共轭面又吸收大部分光。(2)不同型号的光学部件不能互换使用。(3)载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准,不能过薄或过厚。(4)切片不能太厚,一般以510m为宜,否则会引起其他光学现象,影响成像质量。 135.什么是荧光？当一个物体吸收了紫外光或者短波光的能量，它能发射出比原来吸收的波长更长的光，称为“荧光”即：物质吸收短波光，发射出的长波光。136.荧光的特性：1.吸收光，必需有激发光源 2.荧光波长激发波长（损失热能） 3.荧光强度极小于激发光的强度 4.有不同程度的衰减 5.荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率137. 荧光显微镜原理：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光或紫蓝光)作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。138. 荧光显微镜的优点和用途：优点：分辨率比普通光学显微镜高、检出能力高、对细胞的刺激小、能进行多重染色用途：物体构造的观察化学成分等的研究。 可对物质定性、定量分析139. 荧光显微镜的主要特殊配件：1.光源2.两个滤光片3.若为落射式荧光显微镜，则要求特殊的色光分离镜（片）或折光棱镜4.聚光器、物镜、目镜：本身不能发荧光，而且能透过荧光140. 光源：由于荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强度必须很高，即使在近紫外区，也必须有足够的强度。为了满足这些要求，通常采用高压汞灯141. 两种滤光片：1、激发滤片2、阻断滤光片142. 激发滤片：高压汞灯它可发出各种波长的光，每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉143. 阻断滤片：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。144. 荧光显微镜的分类：透射式荧光显微镜：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，适于中低倍观察，厚的或不透明的标本不适用。落射式荧光显微镜（常用）：光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明145. 荧光染色分类：自发荧光、二次荧光、抗体荧光技术146. 使用方法：荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。1.打开灯源（关上可见光光源），超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点2放置标本片，调焦后即可观察3不要用眼直接观察光源，以免引起损伤4高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经30分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。一次观察时间不要太长。147. 体视显微镜：体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜其成像为正立三维的空间影像，并具有立体感强、成像清晰宽阔、长工作距离（通常为110mm）以及连续放大观看等特点生物学上常用于解剖过程中的实时观察 148. 普通光学显微镜的光源为平行光，因而形成的是二维平面影像；149. 体视显微镜采用双通道光