柔嫩艾美尔球虫感染鸡生成细胞及血清变化.doc

柔嫩艾美尔球虫（Etenella）感染鸡IsG生成细胞及血清IgG变化鸡球虫病是危害现代化养鸡业的重大疫病。由于耐药虫株的产生，耐药周期的日益缩短和研制新药费用的增药物防治球虫病这一传统方法而一着严峻的挑战，而免疫预防则有着巨大的潜力和应用前景。为了制作具有充分保护力的球虫疫苗，必须阐明鸡球虫病保护性免疫机制，体液免疫在鸡球虫病中的作用众说纷纭，有人认为血清中的特异性IgG水平与抗球虫感染的保护力无相关性，而Smith等却认为种蛋鸡感染Emaxima后，卵黄中含有抗Emaxima的IgG抗体，此抗体可使雏鸡获得抗同源Emaxima感染的免疫力对Etenella的感染也具有部分保护力。为此，本试验通过对Etenella感染鸡抗Etenella能力的测定，进一步探明鸡对Etenella的体液免疫机制。1材料与方法11虫株纯种Etenella卵囊，由上海家畜寄生虫病研究所提供。通过健康小公鸡传代，按常规方法进行分离、纯化，孢子化后置4备用。12试验动物1日龄海兰白公雏鸡(八一种鸡场提供)。饲养于经严格消毒的铁丝鸡笼内，给予连续的人工光照和标准日粮(不含抗球虫药)，环境、饲料、用具等均严格消毒；300日龄海兰白种蛋鸡。13主要试剂酶标兔抗鸡IgG(SIGMA公司产品)；硝酸纤维素膜(NC)，孔径045m，(浙江黄岩化工厂产品)；3，3一二氨基联苯胺(DAB)(北京北方同正公司产品)。14EteneUa可溶性孢子化卵囊液的制备按蒋建林的方法制备。15Etenella感染鸡血液中特异性IgG和免疫器官IgG生成细胞的测定将160只公雏于第10日龄随机分为T组和C组，每组80只，T组感染剂量为81o4个只，在感染后第2、3、4、6、7、9、12、16、18、20、22d每次捕杀T组和c组各5只，取盲肠、盲肠扁桃体、脾脏、法氏囊和胸腺，经10中性缓冲福尔马林固定液固定，石蜡包埋，切片(4m)，直接酶标抗体染色法，在400光镜下，对胸腺皮质、髓质，脾脏的动脉周围淋巴鞘、淋巴小结，盲肠的弥散性淋巴组织、淋巴滤泡，盲肠扁桃体的弥散性淋巴组织、淋巴小结，法氏囊的皮质和髓质等部位分别观察。凡在细胞核淡蓝色背景下局部细胞浆呈棕黄色着染的判断为阳性，否则判断为阴性。计算IgG生成细胞数占全部淋巴细胞数的百分比。于剖解取材时，T组和C组各取l0只鸡，心脏采血，分离血清，采用DotELISA法检测循环血液中特异性IgG含量的动态变化。16不同抗体水平的雏鸡对Etenella抵抗力的测定161种鸡免疫将300日龄种蛋鸡100只分为免疫组(I组)和非免疫组(u组)，每组50只，I组第一次用5000个只Etenella孢子化卵囊口服，第7d后，以10000个只Etenella孢子化卵囊免疫，第28d时，50000个只Etenella孢子化卵囊加强免疫。U组不免疫，于末次免疫后第5d，开始收集I、U组种蛋孵化。162雏鸡抗Etenella能力的测定将孵出的小鸡剔出弱雏后，取I组和U组各80只，将I组和U组小鸡分别分为2组，每组40只，即免疫攻毒组(TI组)、免疫不攻毒组(CI组)、非免疫攻毒组(TU组)和非免疫不攻毒组(CU组)。分别于第3、9、15、21日龄，空腹称重，并以每只鸡70000个Etenella孢子化卵囊攻毒(CI组和CU组不攻毒)。各组鸡分别于攻毒后第6、7、8d收集粪便，计算粪便OPG值(3d均值)，并于第8d空腹称重后，剖解，分离盲肠中球虫卵囊，计算盲肠内容物OPG值，进行病变计分和计算抗球虫指数(AIC)。1I组和Tu组在每次攻毒前称重时，心脏采血(1O只，次)分离血清，用DotELISA法检测血清中特异性母源抗体IgG水平。17数据处理将所得数据进行方差分析，检验T组和c组的差异显著性。并对雏鸡的抗球虫水平和母源抗体滴度变化进行相关性分析。2结果21盲肠粘膜中IgG生成细胞数的动态变化阳性细胞主要位于盲肠粘膜固有层淋巴滤泡和弥散淋巴组织，T组IgG生成细胞从第3d开始增加，第12d达到峰值。22盲肠扁桃体中Il生成细胞数的动态变化盲肠扁桃体中的阳性细胞主要集中于粘膜固有层和粘膜下层的淋巴滤泡和弥散性淋巴组织。IgG生成细胞在攻毒后的第2d即有显著增加。峰值在第9d，然后逐渐下降，于第18d降至c组水平。23胸腺中IgG生成细胞数的动态变化胸腺中阳性细胞数量很少，主要分布于髓质。在攻毒后的整个过程中，有2个峰值，分别出现在感染后第4d和第18d，整体变化起伏不定，无明显规律。24法氏囊中IgG生成细胞数的动态变化法氏囊中的阳性细胞无论皮质、髓质均分布较多，尤其以髓质部分布密集。IgG生成细胞从感染后第3d开始即显著增加，并持续到第22d。峰值位于第16d。25脾脏中IgG生成细胞数的动态变化脾脏中的阳性细胞主要分布于白髓的淋巴小结、动脉周围淋巴鞘，红髓中的脾索内也含有少量的阳性细胞。IgC生成细胞在感染后第4d开始增加，第12d达到峰值。26雏鸡感染Etenella后血清中特异性IgG含量动态变化结果雏鸡初次感染Etenella后，第6d血清中开始检测出特异性IgG，随后抗体水平逐渐升高，于第18d达到峰值，持续4d后，开始下降，第30d时已降至感染后第7d的水平。27母源IgG水平与雏鸡抗球虫能力的关系用70000个Etenella孢子化卵囊攻击同日龄不同母源抗体效价的雏鸡，母源抗体效价较高雏鸡相对增重率和抗球虫指数明显高于母源抗体效价低的雏鸡，而且粪便OPG值和盲肠病变值也远远低于母源抗体效价低的雏鸡。随着雏鸡日龄增大，雏鸡血清中母源抗体效价也下降，雏鸡抗球虫能力也随之下降。母源抗体IgG与抗球虫指数、相对增重率呈明显正相关，与盲肠病变值、粪便OPG值呈明显负相关。3讨论雏鸡初次感染Etenella后，在第2d和第3d第一代裂殖生殖期，主要免疫器官脾脏、法氏囊、盲肠扁桃体和盲肠局部的IgG生成细胞就开始增殖，并分泌特异性IgG，IgG生成细胞数量于攻毒后第916d先后达到峰值；雏鸡初次感染Etenella后于第6d即可在循环血液中检测出特异性IsG，随后抗体水平逐渐上升，在第18d达到峰值，第30d时下降至感染后第7d的水平。成熟卵囊被鸡吞食后，在肌胃中受机械力作用囊壁破裂，释放出4个孢子囊。孢子囊在十二指肠和小肠中部受胆汁和酶的作用，子孢子逸出。子孢子一逸出，就侵入宿主的肠绒毛部粘膜上皮细胞，然后经巨噬细胞和上皮间淋巴细胞进行转移，再进一步发育。在上述过程中，巨噬细胞和上皮间淋巴细胞给辅助性T细胞(TH)提供抗原信息，TH接受抗原信息后，通过释放一些可溶性因子作用于B细胞，使处于休眠态的B细胞活化，并增生和分化，先转化为浆母细胞，进而增殖为浆细胞，产生和分泌特异性抗体到体液中，从而发挥抗体的抗球虫作用。这个作用的形式之一是抗子孢子抗体可与子孢子结合，抑制子孢子侵入到肠上皮细胞内。鸡球虫的免疫是由抗体、补体、吞噬细胞、sI和淋巴因子等因素综合作用而产生的。本试验结果中同日龄高水平母源抗体的雏鸡抗球虫能力较低水平的雏鸡高，而免疫母鸡经鸡蛋传给雏鸡的特异性抗体主要是IgG，从而证明了血清中I是参与抗球虫作用的，与Smith(1994)的报道一致。现已肯定：血清中的特异性抗体可与原虫表皮膜抗原结合，由于其刺激作用，激活补体，从而使原虫表皮膜被补体成分溶解，即具有溶解子孢子和裂殖子作用。血清抗体还有调理素作用，就是使巨噬细胞捕