细胞免疫荧光操作要点.docx

细胞免疫荧光：取对数生长期细胞，用0.25胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到24孔板中，置5C02培养箱培养1天，待细胞接近长成单 层，取出孔板，4多聚甲醛37，固定30min，含1Triton X-l00的PBS溶液37作用30min增加细胞膜的通透性，非免疫动物血清37封闭40分钟，吸净血清后分孔做好标记加入抗体 （1：100），4湿盒过夜，次日预冷的PBS溶液冲洗5分钟3次后避光加入分别相应的荧光标记二抗(1：50)，加入异硫氰酸荧光素 （fluoresceinisothiocyanate，FITC）（绿色）标记的二抗（1：50）置湿盒内，避光37，孵育30分钟，PBS冲洗5分 钟3次后，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（1：1000）避光37复染 细胞核20分钟。PBS冲洗5分钟3次后，使用倒置荧光显微镜（TE2000，NIKON）观察成像。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤同实验组相 同。1Triton X-l00所起的作用应该是溶解膜上的脂质分子，从而增加膜的通透性，使抗体容易进入细胞。一般30min足以，如果是核内蛋白，可以适当增加时间。目的蛋白是NFKBp65，检测它在乳腺癌MDAMB231细胞里的核转位情况，我用的一抗二抗都是CST的，我用的步骤是1 甲醇-20度固定5分钟（建议用4多聚甲醛固定，使用多聚甲醛前（因为一般配好的多聚甲醛都放在4度冰箱内避光保存）平衡至室温再用，否则细胞会遇冷收缩，形态发生改变。不需要透膜。）2 pbs-0.2triton漂洗3次，pbs-1triton破膜15分钟，然后再洗三次洗涤液同上3 5BSA封闭1h4 一抗1:100 4度孵育了近20小时，然后洗三次5 二抗1:150避光室温1h免疫荧光第一步的步骤几注意事项1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化.4. 不知道你的一抗是 在胞浆表达还是在胞核表达如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液.6. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.7. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失.注意,PBS液的PH值要调在7.4左右免疫荧光第二步的步骤及注意事项1. 等抗体孵育过后,取出洗片,这是要注意不要把不同抗体的片子混在一块了(比如冲洗玻片的吸头要一对一,冲完一种抗体后要去掉,换另一个再冲)2. 洗后自然晾干,加荧光二抗(一般这也要摸个浓度,并不能按部就班地照着说明书上稀释),室温孵育45-60分钟,注意要避光,虽说荧光除非再紫外灯下才会淬灭的快,但操作时还是要注意避光3. PBS洗,洗的时候还是要注意避光4. 洗后自然晾干,加第二种荧光探针(我做的是一抗在胞浆表达,加第二种荧光谈针是染核,这样便于计数)孵育10-15分钟,避光条件下作用,洗片时也要避光.5. 自然晾干后,50%缓冲甘油封片.特别需要注意的事项再补充一下：1，接种细胞密度很重要。不要过密或者过稀，这点很重要，直接决定你实验结果的好坏；2，关于固定问题，使用4%的多聚甲醛，效果还是不错的，固定一般室温，时间10分钟就足够了；3，清洗是个关键步骤。免疫染色涉及好多清晰的步骤，因此在清洗的时候一定要小心谨慎，防止细胞被冲掉或挤到一起的现象发生；4，加荧光标记的二抗时一定要注意避光，防止荧光淬灭。而且在荧光显微镜观察的时候也要注意防止光线过强。常见问题分析：背景强，有可能 1、玻片是否处理得当；2、洗片没洗干净；3、洗片用的PBS很脏；4、抗体用前没有稍离心，离心过后取上清进行稀释；5、用的荧光二抗浓度太高，并不是说坑体浓度高就会增强荧光，相反，会增加背景染色。还有