花梨木DNA条形码测定.doc

毕 业 论 文 设计 题 目 海南花梨木 DNA 条形码序列测定 学 号 姓 名 年 级 学 院 系 别 专 业 指导教师 完成日期 海南花梨木 DNA 条形码序列测定 摘摘 要要 DNA 条形码作为生命体所固有的遗传物质 客观存在于细胞内的物 质 不受人为因素干扰 能准确的反映出物种最基本的信息 为了验证国际生命条形码联盟推荐的 MatK trnH psbA ITS2 三个候 选条形码 在珍贵木材降香黄檀 Dalbergia odorifera T Chen 又名花梨木 DNA 条形码测定中的有效性 从基地采摘的降香黄檀叶片中提取 DNA 用特异性引物进行 PCR 扩增 得到三条候选条形码的目的片段 扩增成 功的 DNA 片段可用于进一步测序分析 以 PCR 扩增成功率和测序成功率 初步评价候选 DNA 条形码片段 评选出最优的条形码片段 为今后利用 DNA 条形码鉴定木材和构建木材分子条形码数据库提供理论依据 实验结果 只有 ITS2 的条形码片段测序成功 得到对应的序列 通 过 NCBI 查询黄檀属其他物种的 ITS2 序列 得到 降香黄檀的 ITS2 分子 序列与黄檀属植物均不同 其中与越南黄檀差异最小 其次是多裂黄檀 多重比对后构建该序列的进化树结果说明降香黄檀与越南黄檀 多裂黄檀 有着较近的亲缘关系 但又不属于同一植物类群 且三者有着稳定的遗传 差异性 建议把 ITS2 序列作为鉴定降香黄檀的候选条形码序列 关键词 关键词 降香黄檀 DNA 条形码 ITS2 分子鉴定 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 I I Abstract DNA barcode as the genetic materialin life inherent that objectively existed in the cell without artificial interference It could accurately reflect the most essential information for species In order to verify three candidate barcodes of the MatK trnH psbA and ITS2 recommended by CBOL and the effectiveness in Dalbergia odorifera s DNA barcode Extracted DNA of its leaves from the base using specific primers for PCR amplication The purpose of the three candidates from bar code fragments were obtained and the targeted segment was amplified successfully to be used for sequencing analysis PCR amplification and sequencing success rate could be used for the preliminary evaluation the bar code fragments of candidate DNA Selected the best bar code fragment which provided theoretical basis for using DNA identification of wood and wood construction molecule The results were as follows only ITS2 coded fragment was successfully sequenced and the corresponding sequence was gained By searched ITS2 of other species which belong to Dalbergia from NCBI We got the consion conclusion that ITS2 of Dalbergia odorifera were different with Dalbergia tonkinensis minimum followed by Dalbergia rimosa Multiple comparison after building the sequence of the evolutionary tree result showed that Dalbergia odorifera Dalbergia tonkinensis and Dalbergia rimosa had the close relationship Though they are not belong to the same group of plants and they have a stable genetic diversity So ITS2 sequence can be uesd to identified candidate barcode of Dalbergia Keywords Dalbergia odorifera T Chen DNA barcoding ITS2 molecular identification 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 II 目目 录录 1 前言 1 1 1 分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展 1 1 2 研究的目的与意义 2 2 材料与方法 3 2 1 材料 3 2 2 试剂药品 3 2 3 主要仪器设备 3 2 4 实验步骤 3 2 4 1 条形码片段的 PCR 扩增 3 2 4 2 条形码片段的纯化与检测 5 2 4 3 克隆 6 2 4 4 测序 7 3 结果与分析 7 3 1 条形码片段 PCR 扩增结果 7 3 2 条形码片段测序结果 8 3 3 序列分析 10 4 结论与讨论 11 4 1 结论 11 4 2 讨论 11 致谢 13 参考文献 14 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 0 0 1 前言前言 降香黄檀 Dalbergia odorifera T Chen 又名花梨木为黄檀属植物 异花 授粉 翅果 主要靠种子繁殖 以其枝干 根 心材干燥后入药 具行气 活血 止血 止痢功效 是国家药典收载名贵南药之一 现代研究还发现 降香黄檀具有抗氧化 1 抑制中枢 2 等的作用 3 降香黄檀心材极耐腐 切面光亮 且香气经久不灭 可用于高档家具 工艺品等 野生的降香黄檀大多分布于我国海南省中部和南部 且多生于中海拔 地区 4 一般成片生长 形成了以降香黄檀为上层树种的植物群落类型 5 品种的种质背景复杂和由各居群所处地理位置不同而产生的水热条件差异 都是降香黄檀具有丰富遗传多样性的影响因素 降香黄檀生长较为缓慢 从种植到心材出现需要多年的时间 近年来 其野生资源已遭毁灭性的破坏 濒于灭绝急需保护 6 研究表明 降香黄 檀表现较高的遗传多样性 且其适应环境能力强 因此导致其濒危的主要 原因可能是其极高的药用价值和工艺价值越来越得到人们重视 导致用量 急剧增大 人为乱采滥挖所至 7 原有文献记载的有野生分布点区域 现 已很难再找到该植物 比如 2004 年在三亚的南山附近零星有分布降香黄 檀小树 到 2006 年时 该处已无降香黄檀 现在降香黄檀只有在少数的保 护区有少量分布 及部分植物园引种 收集保存和农民种植所保留下来的 数量十分有限 8 为保护降香黄檀种质资源和遗传多样性 不只需要宣传保 护意识 还要大量地收集现有的降香黄檀种群的种质资源 并加强管理措 施 保持其种群中丰富的遗传多样性 采取就地保护 繁殖 遗传性高且 面积较小的群体 9 相关的职能部门应加大对偷采滥伐的监管力度 尽量 保护每株野生降香黄檀种质资源 全力开展对降香黄檀种质保存及扩大繁 殖的研究 扩大居群规模 同时通过高新技术的应用 建立核心种质库的方 式提高种质资源管理的质量和效率 10 1 1 分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展 分子条形码作为生命体所固有的遗传物质 通过 DNA 水平鉴定技术 已成熟地应用于动植物的鉴定 11 12 作为客观存在于细胞内的物质 不受 人为因素干扰 能更客观且准确的反映出物种的最基本信息 13 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 1 1 分子条形码技术的主要应用于筛选出适合的 DNA 片段 它的黄金时 代开始于 2003 年 现在已成立的生命条形码联盟 CBOL 一个国际自发 组织的联盟 在于支持 DNA 条形码的发展 旨在促进全球的标准化以及 相应的 DNA 条形码研究 分子条形码技术研究的领域集中于针对具体的 科属 针对性地筛选合适的 DNA 条形码 它利用一段标准的 DNA 片段 区域作为物种标识 进而快速准确地进行物种鉴定 14 理想的 DNA 条 形码应当满足 有变异性 丰富的系统进化学信息 标准化 片段短 稳 定易获取 5 个标准 15 在查看参考文献后从众多研究成果中 选择 matK trnH psbA ITS2 三条国际生命条形码联盟所推荐的候选片段应用 于本次研究 19 matK 片段长度约为 1500bp 位于叶绿体基因内含子内 是叶绿体 DNA 编码区进化速度最快的片段之一 编码一种参与转录 RNA 内含子剪 切的成熟酶 20 其在种内种间变异 种内种间差异较大可以作为所研究 的天南星科 柑橘以及近缘植物 姜科砂仁属植物植物 DNA 条形码分类 条形码 21 trnH psbA 片段长度为 318 322bp 是叶绿体间隔区进化速度最快的片 段之一 该片段在很多研究中表现出很好的物种鉴定效果比如洋金花及其 混伪 也可以鉴定山麦冬及其近缘种 在桉属可用于潜在的条形码鉴定研 究 22 ITS2 片段长度为 500 750bp 是核糖 DNA 的内转录间隔区 为主要应 用于系统发生学标记的片段之一 由于该片段进化速度快 被很多的国内 外学者所重视 协和医院陈士林科研组在研究了大量的植物样本后提议把 ITS2 片段作为药用植物 DNA 条形码 23 科学家发现豆蔻属药用植物 葫 芦科和景天属药用植物等等都发现 ITS2 序列可以作为所研究对象的 DNA 条形码 24 如今 ITS2 序列已成立了独立的数据库 数据正不断地在扩充 根据其二级结构保守性 科学家可以通过软件预测出 ITS2 的二级结构 比较其结构的差异同样可以完成鉴定工作 25 1 2 研究的目的与意义研究的目的与意义 降香黄檀野生资源已被大量破坏 濒临灭绝 但因其药用和商业价值 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 2 2 很高 26 所以部分不良商贩受利益驱使 用黄檀属其他树种冒充降香黄檀 进行销售 因它们密度 材色以及构造与降香黄檀极非常相似 27 专业技 术人员用传统的识别方法很难鉴定 普通消费者更是无法区分和识别 这 给消费者造成了巨大的经济损失 也给林业检查和海关人员的识别工作增 加了难度 28 在本次研究中 为了验证国际生命条形码联盟推荐的 MatK trnH psbA ITS2 三个候选条形码对降香黄檀分子条形码测定的有效性 用特 异性引物对降香黄檀 DNA 进行 PCR 扩增 扩增成功的 DNA 片段用于进 一步测序分析 测序成功的条形码片段可用于降香黄檀的研究鉴定 以 PCR 扩增成功率和测序成功率初步评价候选 DNA 条形码片段 为今后 利用 DNA 条形码鉴定木材和构建木材分子条形码数据库提供理论依据 2 材料与方法材料与方法 2 1 材料材料 基地种植的降香黄檀 采摘树叶提取的 DNA 作为实验模板 2 2 试剂药品试剂药品 琼脂糖 TAE Goldview TaKaRa Ex Taq 6 10 Loading Buffer dNTP Mixture 灭菌 ddH2O AL2000 MarKer 2 3 主要仪器设备主要仪器设备 电子天平 量筒 烧杯 PCR 仪 凝胶成像系统 高速冷冻离心机 低温冰箱 移液枪 eppendprf 2 5 L 10 L 20 L 50 L 100 L 移液管 微波炉 紫外分光光度计 NanoDrop ND 1000 涡旋仪 IKA 恒温摇床 电泳仪 电泳槽 恒温水浴锅 恒温培养箱 超净 工作台 手掌型离心机 2 4 实验步骤实验步骤 2 4 1 条形码片段的条形码片段的 PCR 扩增扩增 1 扩增引物 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 3 3 特异性的 PCR 扩增也同样要求引物的特异性 产物的特异性程度依 赖于扩增引物和模板的互补程度 在本次研究中采用的引物长度为 20 至 23 GC 的含量为 40 60 且没有连续排列的 5 个碱基 29 引物名称和 序列见表 1 表 1 候选条形码片段的扩增引物 Table1 Primers for each candidate barcoding sequences amplification 扩增片段 Target segments 引物名称 Primer name 引物序列 5 3 Primer sequence 5 3 M1CGATCTATTCATTCAATATTTC 22 MatK M2TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT 22 T1GTTATGCATGAACGTAATGCTC 22 trnH psbA T2CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 23 I1ATGCCTCAATCCAGAGAGACCC 22 ITS2 I2TAGCCCCGCCTGACCTGAG 19 2 PCR 反应体系 采用 25 L 反应体系 各反应成分 0 12 L TaKaRa Ex Taq 2 5 L 6 10 Lodaing Buffer 2 L dNTP Mixture 1 L 上游引物 1 L 下游引物 1 L DNA 模板 加入 17 L 灭菌 ddH2O 至总体系 25 L 3 PCR 反应条件 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 4 4 表 2 候选条形码片段的 PCR 反应条件 Table2 PCR conditions for candidate barcoding sequences 扩增片段PCR 反应条件 MatK 94 4min 94 1 min 48 1 min 72 1 min 30 cycles 72 7 min trnH psbA 94 1 min 94 C 1 min 61 1 45s 72 1 min 30 cycles 72 7 min ITS2 94 4 min 94 1 min 56 4 1 min 72 1min 30 cycles 72 7 min 配置 25 L 反应体系 用 0 5 的琼脂糖凝胶电泳检测样本 DNA 左 边第一孔用移液枪注入 5 L AL2000 做对照 取 1 L 6 10 Lod aing Buffer 5 L 样本 DNA 混合点样于胶孔中 设置电泳仪 U 120V I 220mA 25 分钟后取出凝胶置于凝胶成像系统中紫外灯源下 观察 PCR 产物条带 2 4 2 条形码片段的纯化与检测条形码片段的纯化与检测 1 条形码片段的纯化 采用天根柱式核酸纯化试剂盒纯化 PCR 产物 根据电泳检测结果灵 活确定待纯化条形码片段的 PCR 量 在紫外灯源下 用锋利的手术刀片将单一的目的条形码 PCR 产物条带 切下 置于灭菌离心管中 并称重 取 500 L 平衡液 BL 活化 CA2 吸附柱 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 5 5 按所切下的产物凝胶质量 加入 3 倍体积溶胶液 PN 50 水浴 10min 期间上下颠倒数次 确保胶块充分溶解 若依旧有未 溶胶块 补加适量溶胶液或延长水浴时间 直至胶块完全溶解 待冷却至室温的胶块溶解液加入一个吸附柱 CA2 中 室温放置 2min 13000 g 离心力离心 45s 丢弃流出液 加入 600 L 漂洗液 PW 到吸附柱 CA2 中 13 000 g 离心力离心 1min 丢弃流出液 将吸附柱 CA2 放入收集管中 重复本操作一次 将吸附柱 CA2 放置收集管中 14000 g 离心 2min 除尽漂洗液 室温放置吸附柱 CA25min 彻底地晾干 避免残留的漂洗液对下一步的 实验造成影响 将吸附柱 CA2 置于一个干净离心管中 加入 35 LddH2O pH8 0 到吸附 膜中间位置 室温放置 2min 13000 g 离心 2 min 收集 DNA 流出液 将离心所得溶液重新加回吸附柱中 室温放置 2min 13000 g 再次离 心 2min 得到纯化后的条形码 PCR 产物 2 电泳检测纯化后的条形码 PCR 产物 用 0 5 的琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的条形码 PCR 产物 取 5 L AL2000 做对照 取 5 L 纯化产物与 1 L 6 10 Lodaing Buffer 混合后 点样 于凝胶孔中 设置电泳仪 U 120V I 220mA 25 分钟后取出凝胶置于凝 胶成像系统中紫外灯源下观察 PCR 产物条带 2 4 3 克隆克隆 1 纯化产物低温连接 于超净工作台上吸取 4 L 纯化后的条形码 PCR 产物 1 L T Vector 和连接液 Solution 至同一 PCR 管中 轻弹管壁 使各组混合均匀 用手 掌型离心机快速离心 集中溶液 然后置 PCR 管于 PCR 仪上 16 连接 20min 反应结束后将离心管置于冰上 2 大肠杆菌转化 在超净工作台上 取 50 L 感受态细胞并同时加入 5 L 连接产物 在感受 态细胞刚刚解冻时加入链接产物 轻弹混匀后于冰中 30min 结束后 42 水浴 热激 30S 迅速再次冰浴 2min 向混合液离心管中加入 250 L 灭菌 LB 培养基 不含氨苄青霉素 混 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 6 6 合均匀后 于震荡培养箱 37 200 转 min 震荡培养 1h 可使得大肠杆菌 复苏 取 80 L 2mg mlIPTG 和 40mg mlX gal 混合 并均匀地涂布在准备好的 平板上 在 37 培养箱中放置 30min 待 IPTG 和 X gal 被吸收后 取 200 L 菌液均匀地涂在平板上 在 37 培养箱中过夜培养 为得到更多的克隆 4000 转 min 离心 1min 弃掉部分 上清 保留 100 150 L 轻弹悬浮菌液 取全部菌液涂板 3 蓝白菌斑筛选 超净工作台上挑选白色单菌落 置于 LB 培养基中 含氨苄青霉素 37 恒温震荡培养 5 6h 鉴定阳性克隆需要以培养的菌液为模板 菌液 PCR 扩增目的条形码片段 PCR 反应体系与反应以鉴定阳性克隆 PCR 反应体系及条件与以叶片 DNA PCR 扩增目的片段体系条件一致 2 4 4 测序测序 将鉴定转化后的菌液中的 11 22 25 30 34 40 43 共七个样品寄送深 圳华大基因科技有限公司实验室测序 采用 ABI 3730XL 测序仪 采用正 反双向测序确保测序结果的可信度 采用 DNAStar Lasergene 6 软件处理 返回的序列 拼接和去引物 得到各样本的片段序列信息 3 结果与分析结果与分析 3 1 条形码片段条形码片段 PCR 扩增结果扩增结果 DNA 条形码鉴定研究工作的核心在于筛选和鉴定 探索出合适的扩 增引物 摸索建立起高效的扩增条件体系 然后评估对候选条形码序列的 PCR 扩增成功率 以及测序所得高质量的序列的测序成功率 这是对条形 码片段的初步评估 扩增 测序成功率的高低直接影响了后续条形码序列 分析 通过实验得到三种引物 PCR 扩增结果如下图 matK 片段的扩增成功 率低 在凝胶成像图中找不到条带 trnH psbA 片段和 ITS2 片段 均有结 果 而经过纯化后的产物凝胶显示 ITS2 的条带更为清晰 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 7 7 图 1 三种引物的 PCR 扩增产物电泳分析 Figure1 Electrophoretic analysis of three kinds of primers for PCR products M DNA marker AL2000 1 2 ITS2 3 4 trnH psbA 5 6 MatK 图 2 PCR 扩增产物纯化电泳分析 Figure2 Electrophoretic analysis of purified PCR products M DNA marker AL2000 1 3 ITS2 4 6 ITS2 7 9 trnH psbA 3 2 条形码片段测序结果条形码片段测序结果 将回收得到的 trnH psbA 片段 ITS2 片段进行克隆 菌液 PCR 验证 图 3 挑取检测效果较好的条带测序 测序结果中 样品 DNA 的 trnH psbA 片段均未得到对应序列 只得到 ITS2 序列长度为 654bp 如下 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 8 8 ACCTGAGGTCGCGTCGTGGGCGATCGACATCGCTCGCGGGTCGC TGGGTACGGAGCTGGTGGAGGCCGCCCTCATGACTGGCCTCGAGAA CACGCTCAACCACCGTCTGTCATGGCGCTGCATCCACCACGAACCCG ATTTTCAGCCAGCCGCGAGGCGGTGCTCACGGGAGGCCAGCATTCGC CCCGCTCCGTGGCCGGAGGCACAGGGGTTGGGGCGGCGATTGGTGA CACCCAGGCAGGCGTGCCCTTGGCCTAGTGGCTTCGGGCGCAACTTG CGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGT ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCGAGATATCCG TTGCCGAGAGTCGTTTTGGACTCGAGTGTTGCGACGTCGCCCGTGCG AGCACCGTTTCCGGGCCGACGGGACGCGCTCTGCGATTGTTGATTCC TTGGCGCTTTCCGCGCCGGGGTTTGTTGGTTGTTTCGCCGGGACGAG AGGCCGCGGGGCGCGGCTCCGTCCCGACTTTGAGGGAAGGCGAGCT GCTGGGCAGCTTCGTCTGTCCCGGGTGTTGAAACGTGTCCGCGGGTC TCTCTGGATTGAGGCATAAGGGCAATTCTGCAGATATCCATCACACT GG 图 3 克隆菌液 PCR 产物电泳检测 Figure3 Electrophoretic analysis of PCR products of cloning escherichia coli M DNA marker AL2000 ITS2 1 38 trnH psbA 39 48 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 9 9 3 3 序列分析序列分析 根据 NCBI 中已登录的黄檀属分子的 ITS2 序列 用 DNAMAN 做比 对 样品 ITS2 分子序列黄檀属其他植物均不同 其中与越南黄檀差异最 小有 8 个位点碱基不同 其次是多裂黄檀有 15 个碱基不同 表 1 降香黄檀 越南黄檀和多裂黄檀的特异性鉴别位点 Table 1 Identification sites of Dalbergia odorifera T Chen Dalbergia tonkinensis and Dalbergia rimosa Roxb in different origin sites 通过 NCBI 中已登录的黄檀属其他 13 个树种和国槐属植物国槐的 ITS2 序列 所得序列进行多重比对后采用邻接 NJ 法构建系统进化树 见 图 4 结果显示 外类群槐属植物的国槐单独聚为一枝 与传统分类结果 相一致 系统发育树结果说明降香黄檀与越南黄檀有着较近的亲缘关系其 次才是多裂黄檀 但它们又不属同一植物类群 且三者有着稳定的遗传差 异性 位点 N0 32707834 5 40 6 43 5 44 1 53 0 59 7 63 5 63 6 63 7 63 8 63 9 64 2 64 5 样品CGTAGTCGGGGGCATG 越南 黄檀 CTTAGTCGGCAATGCT 多裂 黄檀 TGGGTGTCACAATGCT 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 10 10 图 4 降香黄檀 ITS2 序列与其他物种该序列的进化树分析 Figure4 Phylogeny tree obtained by method based on the ITS sequnence 4 结论与讨论结论与讨论 4 1 结论结论 实验结果表明降香黄檀 DNA 片段 用三种特异性引物扩增 MatK trnH psbA ITS2 片段 其中 trnH psbA ITS2 均有扩增产物但只 有 ITS2 通过 PCR 扩增成功 且扩增成功的 DNA 片段可用于测序分析 对降香黄檀分子条形码测定的有效性最高 通过 NCBI 查询降香黄檀 ITS2 序列和其他黄檀属植物不同 其中与 越南黄檀差异最小其次是多裂黄檀 多重比对后构建降香黄檀 越南黄檀 和多裂黄檀的系统发育树显示了三者有相当近的亲缘关系又不属于同一物 种 建议把 ITS2 作为鉴定降香黄檀的候选片段 4 2 讨论讨论 随着社会的不断进步和经济的高速发展 人们对木质材料 特别是高 档木材制品的需求日益增加 出现了大量的非法采伐和过度采伐的现象 同时由于高档珍稀木材与普通木材在价格上有着大较的差异 在经济利益 的驱使下 高档木制品市场上出现了大量的假冒伪劣产品 给消费者造成 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 11 11 了非常大的经济损失 因此 为维护消费者合法利益 规范木材贸易市场 以及保护生态环境 对木材进行快速 准确 科学的识别鉴定就显得十分 重要和迫切 本研究以基地种植的降香黄檀 Dalbergia odorifera T Chen 为研究 对象 通过叶片 DNA 提取 纯化和 ITS 序列测序 从而揭示降香黄檀和 越南黄檀 多裂黄檀 DNA 序列之间的差异 为降香黄檀木材种属鉴定提 供可靠的分子标记依据 本研究中有一些后续仍需要改进的地方 比如 运用了较为易于提取 DNA 的叶片 可以为苗木鉴定提供可行的检测手段 但在实际应用中市 场上辨别木材是很难找到对应的叶片用于检测 而木材 DNA 的提取与扩 增相对于叶片比较困难 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 12 12 致谢致谢 岁月如梭 如歌 转眼间 大学四年美好的学习时光已接近尾声 感 谢一直在身边陪伴着我 呵护我成长的父母 衷心的感激这些年来对我悉 心教导 诲人不倦的老师们 感谢在学习中给予我支持与帮助的同学 感 谢在四年宿舍生活中 包容我 鼓励我的舍友们 感谢这一路走来都有你 们 能让我能在遇到困难的时候 有勇气克服困难 爬起来继续往前走 毕业论文得以顺利完成 我要衷心的感谢 W 老师 感谢老师在在繁 忙的授课与科研中抽出时间给予耐心的教导和帮助 此外我还要感谢实验 室的师兄师姐 特别是 L 师姐对我耐心的帮助 悉心的指导 在此我还要 感谢和我一起做 降香黄檀分子条码确定 的 M 同学花了一个暑假的时 间提出了降香黄檀的 DNA 谢谢你们 我知道明天有风雨也有彩虹 我 有勇气 自信和能力经历风雨迎接彩虹 不辜朋友 老师和家人的期望 降香黄檀 DNA 条形码序列测定 13 13 参考文献参考文献 1 姜爱莉 孙利芹 降香抗氧化成分的提取及活性研究 J 精细化工 2004 21 7 525 528 2 张磊 刘干中 降香的中枢抑制作用 J 上海中医药杂志 1987 12 39 40 3 何明通 海南岛降香资源的调查 J 中药材 1987 6 20 21 4 马文辉 钟琼芯 符永登 海南省珍稀濒危植物和重点保护野生植物 J 海南师范 学院学报 2003 16 4 68 71 5 毕和平 宋小平 韩长日 等 降香檀叶挥发油成分的研究 J 中药材 2004 27 10 733 735 6 黄晓丹 张云贵 应铁进 高质量植物基因组 DNA 的提取 J 植物生理学通讯 2006 42 2 311 314 7 杨新全 冯锦东 魏建和 等 我国特有濒危药用植物降香黄檀遗传多样性研究 J 世界科学技术 中医药现代化 2007 9 2 73 76 8 孟慧 谢彩香 杨云 等 降香黄檀产地适宜性分析 J 时珍国医国药 2010 21 9 73 77 9 李大周 曾祥全 海南黄花梨栽培技术 M 海口 三环出版社 2007 10 马文辉 钟琼芯 符永登 海南省珍惜濒危植物和重点保护野生植物 J 海南师 范学院学报 2003 16 4 68 71 11 Floyd R Abebe E Papert A et al Molecular barcodes for soil nematode identification Mol Ecol J 2002 11 4 39 50 12 Hebert P D Ratnasingham S DeWaard J R Barcoding animal life cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related species Proc Biol Sci 2003 270 96 99 13 马兰 黄原 生物分类学发展的新方向 DNA 分类学 J 黄冈师范学院学报 25 40 43 14 Hebert P D Gregory T R The promise of DNA barco