常用核酸染料.doc

题目：常用核酸染料商品编号商品名称激发/发射峰应用规格D1306DAPI358/461blueSemi-permeant （半透性）AT-selective （AT-碱基专一性）Mycoplasma(支原体)Chromosome and nuclei counterstain Chromosome banding(复染剂)10mgD3571（dilactate,乳酸基团，水溶性更好）D21490（高纯度）H1398Hoechst 33258（二联苯胺）；33342（三盐酸亚精胺）；334580（五水）；激发峰不同。352/461 bluePermeant (全透性)AT-selectiveMinor groove-bindingdsDNA-selective binding（双链DNA特异结合）Cell-cycle studies（细胞周期）Chromosome and nuclear counterstain（复染剂）100mgH3569（液体）10mlH21491（高纯度）100mgP1304MPP3566P21493PI530/625Impermeant(非透性)Dead-cell stain（死细胞染料）Chromosome and nuclear counterstain（复染剂）100mg10ml100mgA1324ACMA419/483 blueUV？AT-selective （AT-碱基专一性）Alternative to quinacrine for chromosome Q banding(Q显带) Membrane phenomena(膜现象, 阴阳离子跨膜运动)100mgS7563SYBR Green I nucleic acid gel stain* 10,000X concentrate in DMSO*494/521双链DNA和寡核苷酸超敏感电泳凝胶染料；定量PCR500ulS75671mlS758550ul，共20瓶S7564SYBR Green II RNA gel stain *10,000X concentrate in DMSO*492/513RNA和单链DNA染料500ulS75681mlS758650ul，共20个S7580SYBR Green nucleic acid stain starter kit试剂盒包括50 L of SYBR Green I 染料, 50 L SYBR Green II RNA gel stain 染料和a SYBR Green/Gold gel stain photographic filter个S34854SYTO 9-63 fluorescent nucleic acid stain - 5 mM solution in DMSO419/445-654/675细胞内核酸染料，颜色全，蓝色、绿色、橙色和红色；与核酸结合弱，一般不用于复染剂，能看到染料的在胞质内扩散250ulD1306Y3601N21485P3566DAPI：蓝色YOYO-1：绿色Hoechst s769121:黄色PI: 橙色红色蓝色、绿色、黄色和橙红色，核和染色体复染剂F1200Fura-2, pentapotassium salt细胞内Ca离子指示剂，需微注射1 mgF1221Fura-2, AM乙酰羟甲基酯形式，不带电荷的亲脂性化合物，易于渗透脂膜进入活细胞，释放Fura-2，与Ca结合释放荧光1 mgF1241fluo-3 AM488nm特点：能用488nm可见光激发，对生理过程干涉小。适用广10 x 50 gF14201Fluo-4 AM488nm专利产品，信号更强10 x 50 g1.核酸染色细胞凋亡检测试剂盒Cat# Viable cell stainApoptotic cell stainDead cell stainExcitation Application V13240None AF488-Annexin VSYTOX Green（非透性，深绿色）488nm都是绿色，还有其他通道可选，活细胞无色；用于Turkat cells;流式细胞仪V13241NoneAF488-Annexin VPI(red)488nm标记Annexin V，凋亡细胞绿色，死细胞是红色，活细胞无色；流式细胞仪，荧光显微镜V13242NoneFITC- Annexin VPI(red)488nm标记Annexin V，凋亡细胞绿色，死细胞是红色，活细胞无色；流式细胞仪，荧光显微镜V13243NoneYO-PRO-1(选择性透过，绿色)YO-PRO-1PI(red)488nm标记Annexin V，凋亡细胞中等绿色，死细胞核酸染色是红色，活细胞无色；流式细胞仪，荧光显微镜V13244Hoechst 33342 DimHoechst 33342(Blue)-Bright（更亮）PI(red)UV&488nm凋亡细胞更蓝;死细胞核酸染色是红色和蓝色，活细胞蓝色；流式细胞仪，荧光显微镜V23200NoneBiotin-X annexin V and AF350 streptavidinPI(red)345nm&535nm标记Annexin V，活细胞蓝色，死细胞核酸染色是红色；流式细胞仪，荧光显微镜V23201Hoechst 33342 DimYO-PRO-1Hoechst 33342YO-PRO-1PI(red)UV&488nm标记核酸，活细胞蓝标记核酸，凋亡细胞绿色死细胞核酸染色是红；流式细胞仪，荧光显微镜V35112NoneR-Phycoerythtin- Annexin V(Orange)SYTOX Green488nm标记Annexin V，凋亡细胞橙色，死细胞核酸染色是红；流式细胞仪，荧光显微镜V35113NoneAllophycocyanin- Annexin V(Far Red)SYTOX Green488nm&633nm标记Annexin V，凋亡细胞紫红色，死细胞核酸染色是红；流式细胞仪，荧光显微镜V35114C12-resauzurin(red)Allophycocyanin- Annexin V(Far Red)SYTOX Green488nm&633nm凋亡初期：凋亡细胞紫红、活细胞中橙、无绿色死细胞，晚期：紫红、浅橙、绿色，活细胞：深橙色V35116MitoTracker RedAF488-Annexin VNone488nm凋亡初期：活细胞红色、很少绿色，凋亡期：活细胞红色、凋亡细胞绿色V35121DyeCycle VioletDyeCycle Violet7-AAD（只染死细胞、红色）405nm&488or532活细胞很少紫色、凋亡细胞深紫色、死细胞紫色和红色V35123NonePO-PRO-17-AAD405nm&488or532活细胞很少紫色、凋亡细胞深紫色、死细胞紫色和红色V35124NonePacific Blue Annexin7-AAD405nm&488or532活细胞很少紫色、凋亡细胞深紫色、死细胞紫色和红色2.TUNEL细胞凋亡检测试剂盒Po-Brdu TUNEL Assay Kit凋亡过程，DNA链断裂，TDT识别片段添加Brdu (dUTP), AF488-anti Brdu 抗体结合上去。另外试剂盒包括PIKit#Cat# substratedyeExcitation Application Kit#1A23210Brdu抗体AF488330nm凋亡细胞绿色，死细胞红色3.蛋白酶细胞凋亡检测试剂盒Caspase-3在细胞凋亡过程中起信号放大作用Kit#Cat# substratedyeExcitation Application Kit#1E13183Z-DEVDAMC330nm凋亡细胞蓝色Kit#2E13184Z-DEVDR110496nm凋亡细胞绿色引用回复 特别的“染料”给特别的你：Invitrogen独家的SYBR GreenER【字体：大 中 小】时间：2006年05月23日 来源：生物通-摘要： 要解决SYBR Green的非特异问题，当然不是只有一条途径。所谓条条道路通罗马，不同于Qiagen或者ABI利用的是提高DNA聚合酶的特异性，“曲线救国”，Invitrogen公司采用直接改造SYBR Green的方法，发展出更特异更灵敏的荧光染料SYBR GreenER qPCR Reagent System。SYBR Green系列荧光染料由于低毒、灵敏度度优于EB而日渐受到科研用户的欢迎，这个原属于Molecular Probes公司的专利随着Probes被并购进入Invitrogen的大家庭，Invitrogen要优化它自然更方便啦。 SYBR GreenER被Invitrogen称为新一代定量PCR荧光检测方法的核心技术之一，相比原有的SYBR Green，最大的优势的发光强度更强更明亮，使得原来检测不到的低丰度DNA的信号更容易被检测到这也就意味着荧光染料的检测灵敏度提高了，从原来的0.1ng左右提高到6pg，应用在定量PCR检测中就使得基因表达数据分析更为可靠。此外，对荧光染料构造的修饰使得减少了染料分子对PCR反应的抑制作用。SYBR GreenER和原有的SYBR Green一样适用相同的滤光片，并不需要增加新的仪器或者新滤光片(filters)。SYBR GreenER可以看作是SYBR Green的兼容升级版了，具体的升级优化如下： RealTime ready 智力大冲浪！答对5题，即获赠美国傲仕优质保温杯！升级step one：快速反应与高灵敏度增加结果可靠性SYBR GreenER这种新颖的DNA结合染料的一个显著特点就是在检测信号上有了大幅度提高，同时也由于SYBR GreenER消除了一些原有SYBR Green对PCR反应的影响（荧光染料结合入DNA小沟，阻碍扩增反应），因此反应时间得到了提升。而对于定量PCR反应来说，时间越长代表着反应越有可能进入平台期，影响数据分析，因此快速的反应也可以在一定程度上增加反应的可靠性（见下图）。（通过对目标DNA的定量PCR扩增，可以从图中看出SYBR GreenER（绿色）比ABI SYBR Green Master Mix (红色)，以及 ABI Power SYBR Green Master Mix (蓝色)早3到4个循环得到数据）同时也正是由于SYBR GreenER在检测信号方面的改进，因此灵敏度在原有的基础上又进了一步，可以百分之百检测到3pg gDNA（约一个人的基因组当量），而这在同类产品中可是是并不常见的（见下）。灵敏度的提高对于检测单拷贝基因是十分之重要的，尤其是对于稀有复制子，如果检测不到很有可能在疾病诊断和治疗方面出现纰漏，影响甚大。（这里我们特别就这个问题咨询了来自Q厂家的专家Ivy，因为上表中Quantitect正是Q家花旦，Ivy表示，Quantitech可以检测低至5个拷贝的模版，用10pg模版也能得到非常漂亮的曲线（“酶”头一蹙，计上心来 Qiagen vs.ABI(II)参考文中图片）（这里顺便插一句，我们常常看到厂家的宣传资料中有和其他品牌的对比实验，这些做实验的专家们一般只擅长做自家的产品，人家的产品做的结果都特不好，所以读者还是要自己多看多思考哦！）而且Q厂家认为光有灵敏度是不够的，定量的特异性更是非常重要的，Q的特异性是通过引物设计和试剂盒中的酶和缓冲体系共同来实现的。试剂盒的特异性体现在：使用同样的引物时，Q的体系反应仅得到特异性产物，但是其他同类产品的体系会出现引物二聚体(NTC曲线上升)，Ct值偏高。）升级Step two：重复特异性可靠的定量PCR数据来自于高度的特异性和可重复性，这也正是传统SYBR Green的缺陷所在，要改善这一点，SYBR GreenER除了采用了新型的这种GreeER染料，而且在混合液里的DNA扩增酶也进行了化学修饰，保证其在常温下不会扩增以及可以长时间4C保存，这种热启动酶活性减少了非特异性扩增。另外SYBR GreenER也同样采用了UNG，减少污染。这样得到的混合体系即使是模板量从6pg到1ng都可以保证阴性对照（NTC，no template control，即将目的DNA以水取代作为模板）的荧光信号都保持在40持平水平（见下），说明了这一混合液的高特异性和高重复性。升级Step three：适合不同系统的多种选择SYBR GreenER目前可以提供三种不同的体系以供选择，包括 SYBR GreenER kits for ABI PRISM （包括 premixed ROX reference dye，获得对照） SYBR GreenER kits for iCycler （包括premixed fluorescein，获得动力学因子（dynamic well factors），可以用于参照） SYBR GreenER Universal（生物通专稿）细胞荧光化学 一、实验目的1、进步熟悉荧光显微镜的使用方法。2、初步了解几种常用的荧光染色方法。二、实验用品荧光显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签三、实验原理荧光法较一般光学方法具有灵敏度高、特异性强、方法简便等优点，因此近年来荧光组织化学特别是免疫荧光技术有了很大的发展。利用荧光技术可研究细胞内化学成分的分布与定位，研究细胞与组织中物质的吸收与转运，进行病理鉴别以及细胞免疫等方面的研究。 当用一种波长的光(如紫外光)照射某种物质时，这种物质会在极短的时问内发射出较照射波长为长的光(可见的光)，这种光就称为荧光。有些生物材料受到紫外线照射后能直接发出荧光称自发荧光(或直接荧光)；有的生物材料受紫外线照射后并不发光，但当它吸收荧光染料后，也同样产生荧光，称间接荧光(或次生荧光)。与生物学有关的荧光现象有五种： 1、 自发荧光 如叶绿索、维生素A的红色荧光、胶原纤维的蓝绿色荧光、脂褐素的蓝色荧光等。2、 诱发荧光 通过诱导剂作用而发的荧光，如甲醛蒸气处理可诱发细胞和组织中生物单胺类(儿茶酚胺、5羟色胺等)产生荧光。3、荧光染料染色荧光 即经染色后荧光染料与细胞中某些成分结合而产生的荧光。4、酶诱发荧光 通过细胞内酶的作用，使某些不发荧光的物质转换为发荧光的产物。如细胞内的脂酶可使不发荧光的二醋酸荧光素分解为发荧光的荧光素。 5、免疫荧光 荧光染料和抗体以共价键结合，这种标记的抗体再和相应的抗原形成抗原抗体复合物，经激发后发射荧光，用以辨认抗原。细胞和组织所产生的荧光必须通过荧光显微镜进行观察或通过显微荧光光度计进行定量测定。除少数生活物质含有自发荧光外，大多数研究需外加荧光染料，进行特异性结合而得以显示。.四实验方法(一)几种荧光染料对细胞染色的观察 细胞吖啶橙荧光染色的观察 ：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。1将生长有培养细胞的玻片或鸡血涂片放入95%乙醇中固定1530分钟，干燥；2在1%醋酸中酸化30秒；3在标本片上滴加足量的001%吖啶橙磷酸缓冲染液，染色5-10分钟；4用pH48磷酸缓冲液洗1分钟；50.1molL氯化钙分化30秒或几分钟；6PBS漂洗三次，每次数秒钟；7在干净载玻片上滴滴PBS，将标本片有细胞面向下临时封固，或在血涂片上滴加磷酸缓冲液后加盖玻片临时封固；8在荧光显微镜下观察，用蓝紫光激发滤片，可见细胞核为绿色，细胞质为橙红色，但常因细胞质的pH值的变化而呈棕色至鲜红色。(二)活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体 一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。1. 用牙签在自己口腔颊粘膜处刮取上皮细胞涂于干净载玻片上；2.滴一滴双荧光染液(含025ugmL Ho33342和若丹明123 1ugmL的PBS液)于细胞上；3.加上盖玻片(注意防止气泡)，用指甲油把盖玻片边缘封好；4.用落射式荧光显微经观察。先用高倍镜观察细胞核(采用紫外光激发滤片双色束分离器内装阻断滤片的组合插块置于光路)，可见核发蓝荧光。再换油镜观察线粒体(换用紫光或蓝光的组合插块)，在细胞核附近的胞质中可见有一些发绿光的圆形和短秆状颗粒分布，即为线粒体。五、荧光组化实验中应注意的几个问题1每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。2一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。3在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。我发现用Goldview染色后,随着电泳时间的延长,紫外照射下的荧光强度越来越弱,如下图:不知道大家用的时候有没有类似的情况出现?有什么好的方法避免吗? 呵呵,你是直接把Goldview加入到胶中进行电泳吧.在电泳时,一般我们都知道核酸由负级向正级泳动.但如果制胶时就加入EB或Goldview的话,这些荧光染料也有自己的泳动方向-正级向负级!正好和核酸电泳迁移方向相反。你的电压(160),呵呵,有些偏大(不晓得你的电泳槽和胶的长度,但感觉还是蛮大,我们一般常的小于120).,10min后,Goldview泳动到红色上边框处(下图),15min后泳动到兰色上边框处,20min后泳动到绿色上边框处,而红、兰、绿方框内是没有荧光染料或仅有微弱的残留。由于没有了Goldview染色，所以电泳20min后你观察不到核酸着色带。但隐约还是可以看到一点点微弱的着色（黄色竖线处）。不是Goldview染料有问题，想避免这种情总发生，可以将Goldview加入电泳液（如果电泳槽体积小，电泳液更换不频繁的话。嘿，为了节约嘛）；也可以制胶时不加入Goldview，先电泳，后染色；当然，也可以把电压调小些，电泳时间短一点！你再试试看！呵呵，EB也是一样哦。EB染色有问题的战友同样可以参考！ 马上就要做荧光检测了，可是在园子里一搜居然这么多方法不太明白ho双染是不是说可看出凋亡，可测出细胞坏死双染后坏死细胞被染成红色，凋亡细胞被染成亮兰色？和是在板子里加完细胞就加，还是培养小时，细胞贴壁后再加？用孔板吗？不清楚，请各位高手帮忙！谢谢！Hoechest/PI双染法检测细胞凋亡的原理是：早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的、能与DNA结合的荧光染料（如PI）不能进入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。利用这一特点，将被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪或荧光显微镜检测细胞悬液中的细胞荧光强度可区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。正常细胞由于对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。具体操作是待细胞处理结束后（贴壁不是标准），收集约10100万个细胞（96孔板单孔应该收集不到这么多的细胞），分别用PI和Hoecha染料染色后，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm），后者荧光为蓝色（480nm）。我做过荧光显微镜观察细胞凋亡，但是Hoechst33342单染，效果同双染差不多，具体操作如下，可供参考：将培养于含盖玻片