挥发性脂肪酸的测定——5种方法.doc

挥发性脂肪酸的测定一般来说，碳原子数在10以下的脂肪酸大部分具有挥发性，并且易溶于水。在它们中间，随着碳原子数的增加，挥发性逐渐下降。典型的挥发酸见附表5。附表5 低级脂肪酸的分子式及沸点名称分子式沸点/名称分子式沸点/甲酸乙酸丙酸HCOOHCH3COOHC2H5COOH100.8117.5140.0丁酸戊酸已酸C3H7COOHC4H9COOHC5H11COOH162.3185.5205.0挥发性脂肪酸易被微生物利用。在有机物的厌氧分解中，挥发性脂肪酸是作为生物代谢的中间或最终产物而存在。在厌氧发酵的液化产酸阶段，这一类低级脂肪酸是这一阶段的主要产物，其中以乙酸为主。在某种条件下，乙酸可以达到该类酸总量的80%。在CH4形成过程中，甲酸和乙酸是形成甲烷的重要前体物。据研究，自然界有机物产生的CH4中大约有70%上由乙酸中的甲基原子团形成的。丙酸、丁酸可以转化成甲酸。有机酸过多往往反映出发酵池的病态。因此可以认为，在微生物厌氧发酵过程中，挥发性脂肪酸不仅是一种不可缺少的营养成分，更重要的意义在于这类有机酸已是沼气发酵研究有机物降解工艺条件优劣的重要参数，在甲烷形成的研究和生产中，它们的含量也是重要的参数。在挥发性脂肪酸的总量测定中，是以乙酸作为基数进行计算，除了要求测定总量外，对甲酸、乙酸等各种低级脂肪酸的分别定量分析也是十分重要的。1 C2C5挥发性脂肪酸的气相色谱测定法2.5.1.1 测定原理使用色谱仪上的氢火焰检测器测定挥发性脂肪酸含量，其基本原理是：色谱柱分离后馏出的物质被载气载入检测器离子室的喷嘴口，与燃烧气氢气相混合，并以空气助燃气进行燃烧，以此为能源，将组分电离成离子数目相等的正离子和负离子（电子）。在离子室内装有收集极和底电极，因此离子在电场内作定向流动，形成离子流。该离子流被收集极收集后，经过微电流放大器放大输送给记录仪得到信号，此信号的大小代表单位时间内进入检测器火焰的组分含量。2.5.1.2 测定条件试剂设备 乙酸、丙酸、丁酸、戊酸混合标准液的配制。分别吸取乙酸（A.R.，相对密度1.045，含量99%）、丙酸（A.R.，相对密度0.9987，含量99.5%）、丁酸（A.R.，相对密度0.8097，含量99%）、戊酸（A.R.，相对密度0.934，含量100%）各25L于50mL容量瓶中，再加入2.5mL甲酸（A.R.，相对密度1.22，含量88%），最后用蒸馏水定容。其中乙酸、丁酸、戊酸的浓度分别为517L/L、497L/L、401L/L、467L/L。 6mol/ L硫酸的配制：将167mL浓硫酸（相对密度1.84）缓慢倒入833mL蒸馏水中。 甲酸：相对密度1.22，含量88%。 离心机400016000r/min。 气相色谱仪，FID检测器。 样品预处理 用沼气发酵液7mL加入2滴6mol/ L H2SO4使pH值降至3.5左右（用pH试纸粗测），离心2030 min，取上层透明清液3mL，加入0.15 mL浓甲酸，最终pH值为2.0左右（控制在3.0以下）。 主要实验参数 条件一。固定相：GDX103+H3PO4，2%(6080目)；色谱柱：2m6mm；柱温：180200；气化室温度：240；检测温度：210；进样量：2L；载气流量：N2，50mL/ min；氢气流量：50 mL/ min；空气流量：600700 mL/ min；衰减：1/8。 条件二。色谱柱：2m3mm，不锈钢柱，内填国产GDX-401担体，6080目；柱温：210；载气：N2，流率为90mL/ min；空气流率：500 mL/ min；氢气流率：50 mL/ min；气化室温度：240；检测温度：210。 条件三。色谱柱：2m6mm，装有以2%磷酸饱和的6080目GDX-103担体；柱温：180200；气化室温度：240；检测温度：210；进样量：2L；载气流量：N2，50mL/ min；氢气流量：50 mL/ min；空气流量：600700 mL/ min； 条件四。色谱柱：2m2mm，玻璃柱，内装有10%的商品固定液FluoradFC431涂布的Supelcoport担体，100200目；柱温：130；气化室温度：220；检测温度：210；载气流量：N2，40mL/ min。 定性与定量 定性。配制模拟标准样品，用已知物质的保留时间对照被测物质的保留时间进行定性。 定量。用已知样校正法进行定量，其方法是配制已知浓度的标准样（与样品组分一致），进行色谱试验，测量标准样各组分的峰高（或峰面积），求出组分i的单位峰高（或峰面积）的组分含量或作出峰高和浓度的标准曲线。当样品组分浓度变化不大时，可采用单位校正法。当样品组分浓度变化很大时，则需预先用校准样作出浓度和峰高或峰面积的标准曲线，观察其标准曲线是不是通过原点的直线，即是否呈线性。若呈线性，就可用单点校正法，按下面的公式计算：待测样品浓度，L/L；待测样品峰高，mm；标准样品浓度，L/L；标准样品峰高，mm；待测样品体积+甲酸体积，mL；待测样品体积，mL。2.5.1.3 方法的精度和注意事项 以GDX103+H3PO42%为固定相，比用GDX101 、PEGS、Porapak.N等作为固定相其保留时间短，且峰形对称。 本法最小检测量为4L/L，相对误差为1.8%，相对标准偏差2.7%（以乙酸计）。 有机酸是一种强极性物质，沸点较高，由于担体对酸的吸附，常常引起酸峰拖尾和鬼峰的出现。因此，取有机酸直接进样测定时，为了抑制酸的吸附，可采取以下措施。 在样品中加入一定量的浓甲酸（相对密度1.22，含量88%），使其甲酸加入量（体积）与样品的体积比为5：100。甲酸是一种一元羧酸，离解常数（2.1110-4）大于其他任何一元羧酸，当含有甲酸的样品进入固定相时，担体表面的吸附中心位置被甲酸暂时占据，这样便抑制了C2C5酸被担体的吸附。此外，甲酸在FID上响应很低，故对其他组分的应答影响不大。 酸的吸附还发生在接近进样口的地方，由于进样口常积累有碳质沉积物，通常采用蒸馏水清洗进样口，并用1.5%磷酸-丙酮液来浸泡进样口，然后在约150的温度下将进样口烘烤48h。 用1.5%磷酸-丙酮液来浸泡柱口玻璃毛。 在分析高浓度时，一定分析周期内注射水或15%甲酸液来洗涤被柱子吸附的酸。 操作条件恒定以后，在进标准酸样或样品之前，用15%的甲酸液来冲洗柱子34次。 柱子使用寿命大约46个月，一旦发现色谱峰出现拖尾或重复性差，则必须更换柱。 尽管采取了一系列防止吸附的措施，但柱子的吸附问题还是不可能完全解决，特别是对于4000L/L以上高浓度的酸样，如何克服吸附问题还值得更进一步研究。 当检测器的灵敏度显著降低或更换新柱之后，重新做校正曲线。2挥发性脂肪酸总量的比色测定法2.5.2.1 测定原理含挥发性脂肪酸的样液，在加热的条件下，与酸性乙二醇作用生成酯，此酯与羧胺反应，形成氧肟酸。在高铁试剂存在下，氧肟酸转化为高铁氧肟酸的棕红色络合物，其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物挥发性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法测定。2.5.2.2 测定方法 试剂 1：1硫酸：浓硫酸（相对密度1.84，C.P.）加到同体积蒸馏水中稀释配制。 酸性乙二醇试剂：取30.0mL乙二醇(C.P.)与4.0mL配制的稀硫酸混合。 4.5mol/L的氢氧化钠：称取180g氢氧化钠(C.P.)溶于水中，冷后以蒸馏水稀释至1L。 10%硫酸羟胺溶液：称取硫酸羟胺(C.P.)10.0g，溶于100mL蒸馏水中。 羟胺试剂：量取20.0 mL4.5mol/L的氢氧化钠，与5.0mL10%的硫酸羟胺相混合。 酸性氯化铁试剂：将20.0g分析纯FeCl3 6H2O溶于500mL水中，准确加入20.0 mL浓硫酸，并以蒸馏水稀释至1L。 测定程序 乙酸标准液的配制。精确称取乙酸（分析纯，相对密度1.045，含量99.0%）1.010g，以蒸馏水稀释至100mL，此溶液含乙酸10mg/mL。准确吸取10 mg/mL乙酸标准溶液1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL、30.0mL，分别置于100.0mL容量瓶内，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得100L/L、500L/L、1000L/L、1500L/L、2000L/L、2500L/L、3000L/L的乙酸标准系列液。 标准曲线的绘制。取相对密度1.045的乙酸（分析纯）试剂，制成50mL/L、100 mL/L、500 mL/L、1000 mL/L、1500 mL/L、2500 mL/L、3000 mL/L的系列标准液，分别吸取0.5 mL分置于试管中（12.5cm1.5cm），每瓶中准确加入，于沸水浴中加热3min，然后立即以冷水冷却；再加入2.5mL羟胺试剂，充分摇匀，然后，充分振荡混匀，以蒸馏水定容，用721型分光光度计以500nm波长测定其光密度，绘制标准曲线，以横坐标表示浓度值，纵坐标表示光密度值。 样品的测定。以400010000r/min的离心条件，制取沼气发酵样品澄清液，吸取0.5mL样液置于试管中（12.5cm1.5cm），准确加入1.7 mL酸性乙二醇试剂，充分混合，于沸水浴中加热3min，应避免试管与加热器壁直接接触。然后立即将试管置于冷水中冷却。加入2.5mL羟胺试剂，并混匀，放置1min，然后全部倒进盛有10mL酸性氯化铁试剂的25mL容量瓶中，用蒸馏水定容，并充分摇匀，静置5min，用分光光度计以500nm波长测定光密度。同样操作做空白试验1份。 计算式中 C样液光密度值相应于标准曲线上挥发酸的含量，mg； V测定样液体积，mL； 测定时液样的稀释倍数。2.5.2.3 注意事项 此方法是挥发性脂肪酸总量的经验测定法，比蒸馏法测定更为简便、快速。除150mg/L以下的低浓度范围外，其测定值相对误差与气相色谱法测定总值的相对误差相近。 此法中的反应是在严格的pH值条件下进行的，最适pH值为1.60.1。pH值高于2.0时，色度加剧，pH值低于1.0时，颜色难以稳定，易消失。 酸性己二醇试剂和羟胺试剂宜使用时配，也可在测定中配入。例如，以加入1.5mL己二醇和0.2mL稀硫酸来代替1.7mL酸性己二醇试剂，以0.5mL硫酸羟胺和2.0mL4.5mol/L的氢氧化钠来代替2.5mL羟胺试剂。 如果所做的空白测定含量酸量超过200mg/L时必须用氢氧化钠蒸馏提纯己二醇 。 酸性氯化铁配制好后，应静置过夜，弃去沉淀。 必须严格遵守操作规程，显色反应必须充分摇动。 比色法没挥发性脂肪酸总量，方便快速，对于特定样品（特别是污水污泥体系）的准确度较高，适合于沼气发酵的常规分析。 3挥发性脂肪酸（VFA）的测定-碳酸氢盐碱度和VFA分析的联合滴定法 挥发性脂肪酸（VFA）是厌氧消化过程的重要中间产物，甲烷菌主要利用VFA形成甲烷，只有少部分甲烷由CO2和H2生成。但CO2和H2的生成也经过高分子有机物形成VFA的中间过程。由此看来，形成甲烷的过程离不开VFA的形成，但是VFA在厌氧反应器中的积累能反映出甲烷菌的不活跃状态或反应器操作条件的恶化，较高的VFA（例如乙酸）浓度对甲烷菌有抑制作用。因此在反应器运行中，出水VFA用作重要的控制指标。在VFA测定中，常进行VFA总量测定，其单位以mmol/L或换算为按乙酸计，以单位mg/L表示。对VFA中各种低级脂肪酸（乙酸、丙酸）的分别定量分析也是重要的，有时常需要知道以COD表示的VFA的量（即VFA以单位mgCOD/L）表示，此时也需要知道VFA中各种有机酸的含量，因此它们换算为COD的换算系数是不同的。VFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸以及它们的异构体。在运转良好的高速厌氧反应器中，VFA中乙酸可占有很高的比例，但当反应器运行状态不好时，丙、丁酸浓度会上升。（1）分析原理厌氧处理中会产生大量的CO2，在反应器条件下（pH68之间），这些CO2主要以HCO3-形成存在。这是厌氧处理中最重要的pH缓冲物，由HCO3-或主要由HCO3-引起的碱度称为碳酸氢盐碱度。HCO3-产生最大缓冲能力的范围约在pH67。如前所述，HCO3-可以通过滴定测定，但测定过程受到其它一些阴离子的干扰，其中发酵液中常含有的VFA的阴离子是影响碳酸氢盐碱度的主要因素。为此，在荷兰发展了碳酸氢盐碱度和VFA同时进行测量的方法。其原理如下：水样先以0.1000mol/L的HCl标准溶液滴定至PH=3，在这一pH值下，所有HCO3-被完全转化为H2CO3，VFA也几乎完全地转化为其非离子形式。此后，已被滴定至pH3的水样在如图所示的带回流冷凝器的烧瓶中煮沸，所有转化为H2CO3的HCO3-将分解为CO2和H2O，其中CO2完全由其中溢出，而VFA则因为有回流冷凝器而保留在水样中。然后水样以0.1000 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH6.5，在此pH下，所有的VFA和其他弱酸将被转化为其离子形式。由使用的HCl和NaOH标准溶液的量，即可计算出碳酸盐碱度和VFA的浓度。由此得到的结果更易于判断水样在厌氧条件下的缓冲能力。（2）仪器1250ml带磨口烧瓶，250ml烧杯；210ml半微量酸式滴定管；310ml半微量碱式滴定管；4回流冷凝器；5自动电位滴定计；（3）试剂1无二氧化碳水 用于制备标准溶液及稀释用的蒸馏水或去离子水，临用前煮沸15min，冷却至室温。PH值应大于6.0，电导率小于2s/cm。 2酚酞指示液 称取1g酚酞溶于100ml 95%乙醇中，用0.1mol氢氧化钠标准溶液滴定至出现淡红色为止。 3甲基橙指示剂 称取0.1g甲基橙溶于100ml蒸馏水中。 4碳酸钠标准溶液（1/2 Na2CO3=0.0250 mol/L） 称取1.392g(于250烘干4h)的无水碳酸钠(Na2CO3)，溶于少量无二氧化碳水中，移入1000ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。贮于聚乙烯瓶中，保存时间不要超过一周。 5盐酸标准溶液（0.0250 mol/L） 用分度吸管吸取2.1 ml浓盐酸(=1.19g/ml)，并用蒸馏水稀释至1000ml,此溶液浓度0.0250 mol/L。其准确浓度按下法标定： 用无分度吸管吸取25.00 ml碳酸钠标准溶液于250 ml锥形瓶中，加无二氧化碳水稀释至约100ml，加入3滴甲基橙指示液，用盐酸标准溶液滴定至由桔黄色刚变成桔红色，记录盐酸标准液用量。按下式计算其准确度：C=0.025025.00/V 式中， c-盐酸标准溶液浓度（mol/L）； V-盐酸标准溶液用量（ml）。6氢氧化钠标准溶液（0.0250 mol/L）称取60g氢氧化钠，溶于50ml水中，冷却后移入聚乙烯细口瓶中，盖紧瓶盖静置4d以上。然后吸取上层澄清溶液1.4ml，用水稀释至1000ml，此溶液约为001mol/L。其精确浓度可用邻苯二甲酸氢钾标定，标定方法如下： 取基准试剂级邻苯二甲酸氢钾在105-110烘干至恒重。精确称取三份，每份约0.1g（称准至0.0001g），分别置于250ml锥形瓶中，加入100ml水，稍加热使之溶解。然后加入4滴酚酞指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定至淡红色不褪为止。记录下氢氧化钠标准溶液的用量（ml），并按下式计算其浓度：C= =G103/(204.22V) 式中， C-氢氧化钠标准溶浓度（mol/L）； V-氢氧化钠标准溶用量（ml）； G-邻苯二甲酸氢钾重量（g）； 204.22-苯二甲酸氢钾(KH4C8H4O4)摩尔质量(g/mol)。（4）操作步骤 按自动电位计说明书安装、校正好电位计，以蒸馏水清洗电极。 用移液管吸取过滤后的水样Vml（其中含有VFA的量不超过3mmol），加入250ml烧杯中。 将样品水温调制（252），将盛有此样品的250ml烧杯置于滴定台上，投入长约1.5cm的磁力搅拌棒，打开搅拌开关并调置一定搅拌强度，小心将电极放入烧杯的液面下。 如果此样品水样的pH高于6.5，则准确调节至6.5。 然后在自动电位滴定计上滴定此水样至pH3.0，消耗的0.1000mol/LHCl记作Zml。 将此水样转移至磨口锥形瓶中，加入沸石或玻璃珠少许，安装好回流冷 凝器。打开冷却水，加热至沸腾并维持3min以上，撤离酒精灯并等待2min，将溶液移回250ml烧杯。 以NaOH标准溶液滴定至pH=6.5，消耗的NaOH标准溶液记作Bml。（5）结果计算挥发酸（VFA）（mol/l）=(ZCa-BCb)103/V式中， Ca-标准HCl溶液的浓度（mol/L）； Cb-标准NaOH溶液的浓度（mol/L）。4挥发性脂肪酸（VFA）的测定-Q/YZJ10-03-02-20001、范围本标准适用于工业废水厌氧消化过程中消化液中的挥发酸含量的测定。2、引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T 6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（ISO3696-1978）GB12999-1992水质采样样品保存规定。3、方法提要样品中的乙酸、丙酸、丁酸等挥发性有机物在酸性条件下被蒸馏出来，馏出液经回流以除去CO2、H2S、SO2等气体，趁热以酚酞为指示剂用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定，结果以乙酸计算。4、试剂和材料除另有说明，本标准使用的试剂和水，均指分析纯试剂和GB/T6682规定的三级水。4.1 25%硫酸溶液取250毫升分析纯浓硫酸加入约700毫升蒸馏水中，然后加水至1升。4.2 酚酞指示剂称取0.5克酚酞，溶于50ml 95%乙醇中，用水稀释至100ml。4.3 0.1N氢氧化钠溶液配制及标定称取60克氢氧化钠溶于50ml水中，转入150ml的聚乙烯瓶中，冷却后，用装有碱石灰管的橡皮塞塞紧，静置24小时以上。吸取上层清液约7.5ml置于1000ml容量瓶中，用无二氧化碳水稀释至标线，摇匀。称取在105-110度干燥过的基准试剂级苯二甲酸氢钾约0.5克（称至0.0001g），置于250ml锥形瓶中，加无二氧化碳水100ml使之溶解，加入4滴酚酞指示剂，用待标定的氢氧化钠标准溶液滴定至浅红色为终点。同时用无二氧化碳水做空白滴定，按下式计算。氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L）=M1000/(V1-V0) 204.23式中：m称取苯二甲酸氢钾的质量（g）；V0滴定空白时所耗氧氧化钠标准溶液体积（ml）；V1滴定苯二甲酸氢钾时所耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；204.23苯二甲酸氢钾的摩尔质量（g/mol）。5、仪器和设备5.1 500毫升蒸馏装置；5.2 500亳升磨口三角瓶；5.3 球形冷凝管；5.4 25毫升碱式滴定管。6、取样按国家环保局颁布的环境监测技术规范（地表水和“废水”）部分规定采取有代表性的样品采集后应尽快测定或加少量氢氧化钠固定，置于4下保存。7、分析步骤7.1 蒸馏。取300毫升/V5（或适量水样加蒸馏水稀释至300毫升）水样于500毫升的平底蒸馏瓶中，然后加入25毫升25%的硫酸溶液，再加入数粒玻璃珠，进行蒸馏，接取200毫升蒸馏液。7.2 滴定。在另一电炉上加热煮沸回流30分钟，取下三角烧瓶，加3滴酚酞指示剂，趁热用0.1N的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色30秒不褪色为终点。7.3同时按上述步骤用蒸馏水代替水样作空白。8、分析结果计算挥发酸（VFA）（mg/l）= (V3-V4)N60103/V5式中：V3滴定样品时所消耗的NaOH毫升数；V4滴定空白时所耗的NaOH毫升数；V5取样量（ml）；NNaOH溶液的浓度（mol/L）；60乙酸的分子量。9、注意事项9.1 在蒸馏过程中不能使水样直接冲入蒸出液中，若蒸出则需重新取样蒸馏。9.2 当丁、戊酸含量高时，代表性不强，最好用气相色谱法。VAF不能代表乙、丙、丁、戊的各种含量。10、报告10.1 当两次重复测定结果之差不大于算术平均值的10%时，取算术平均值报告、分析结果报告至0.1mg/L。10.2 报告应包括以下内容：a)有关样品的全部资料，例如样品的名称、采样地点、采样日期、采样时间等；b)本标准的代号；c)分析结果；d)测定中观察到的任何异常现象的细节及说明；e)分析人员的姓名及分析日期等。5 VFA的滴定法分析（1）原理 本法原理是将废水以磷酸酸化后，从中蒸发出挥发性脂肪酸，再以酚酞为指示剂用NaOH溶液滴定馏出液。废水中的氨态氮可能对测定形成干扰，因此应当首先在碱性条件下蒸发出氨态氮，如果要同时测定氨态氮，以硼酸溶液吸收后滴定之。因此此法可用于氨态氮和VFA的联合测定。（2）药品10%NaOH溶液NaOH标准溶液，0.1000mol/l10%磷酸溶液，取70ml密度1.7mg/cm3的磷酸用水稀释至1L。酚酞指示剂，1%的乙酸溶液。（3）测定步骤于蒸馏瓶中放入50200ml待测废水，其VFA含量不超过30mmol。如水样体积不足100ml，可以蒸馏水稀释至100ml。放入几滴酚酞指示剂。加入10%NaOH溶液，使溶解呈碱性，并使NaOH略过量。开始蒸馏 ，至蒸馏瓶中剩余的液体为5060ml为止。用蒸馏水将蒸馏瓶剩余液体稀释至原来的体积，用10ml10%的磷酸酸化，在接受瓶中放入10ml蒸馏水并使接受瓶与蒸馏瓶上的冷凝管连接，导入管应浸入接受瓶的液面以下。蒸馏至瓶中液体为1520ml为止。待蒸馏瓶冷却后，加入50ml蒸馏水再次蒸馏，至剩余1020ml液体为止。为了除去二氧化碳、硫化氢、二氧化硫等干扰物，可向馏出液中通入高纯氮气1015min，然后加入10滴酚酞，用NaOH标准溶液滴定至淡粉色不消失为止。（4） 计算挥发性脂肪酸含量计算如下：VFA=V (NaOH)*C*1000/Vs (mmol/L)式中：V(NaOH)-滴定消耗的NaOH标准溶液的体积，ml; c - 滴定消耗的NaOH标准溶液的准确浓度，mol/L;挥发性脂肪酸(VFA)的测定挥发性脂肪酸是厌氧硝化过程的中间产物，甲烷菌主要利用VFA形成甲烷，只有少部分甲烷由CO2和H2生成。VFA在厌氧反应器中的积累能反映出甲烷菌的不活跃状态或反应器操作条件的恶化，较高的VFA浓度对甲烷菌有抑制作用。VFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸及它们的异构体，在运转良好的反应器中，乙酸比例较高，反应器不好时，甲酸、丙酸浓度升高。在VFA测定中，其单位常换算为按乙酸计，以mg/L表示。常用的测定方