《微生物遗传》PPT课件.ppt

第五章微生物遗传变异与菌种选育 西昌学院食品科学系 遗传 具有一定遗传型的个体在一定的培养条件下生长时 子代培养物会表现出与亲代培养物相同的特征 这就是遗传现象 变异 当遗传型发生改变 也就是说当生物体内的遗传物质发生结构上的变化时 生物体就表现出变异现象 第一节遗传变异的物质基础 1 证明遗传物质的三个经典实验转化实验 遗传物质是DNA 噬菌体感染实验 证明DNA是遗传物质 且其中含有合成蛋白质的遗传信息 植物病毒重建实验 遗传物质是RNA 2 DNA的结构与复制 3 遗传物质在细胞中的存在方式 细胞水平细胞核水平染色体水平核酸水平基因水平密码子水平核苷酸水平 第二节微生物的基因突变 广义的突变染色体畸变基因突变 狭义突变 基因突变 由于DNA链中一对或少数几对碱基发生改变 而导致核苷酸序列突然发生稳定的 可遗传的变化 1 突变类型 野生型菌株 具有天然的 非突变性状的微生物 突变型菌株 发生了突变的微生物 1 1按突变所带来的表型改变 形态突变型 如细菌的鞭毛 芽孢或荚膜的有无 致死突变型 合成关键性酶的基因发生突变 表现出致死突变 条件致死突变 如温度敏感型 生化突变营养缺陷型 缺乏合成必须营养物质的突变型 抗性突变型 对某种外界因素抗性提高 1 2按突变的条件和原因 自发诱变诱发突变 2 突变的特点 不对应性自发性稀有性独立性诱变性稳定性可逆性 变量实验 fluctuationanalysis SalvadorLuriaandMaxDelbruck 1943 SalvadorLuria MaxDelbruck TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969 结果 来自甲管的50皿中 各皿间抗性菌落数相差悬殊 而来自乙管的则各皿数目基本相等 这说明大肠杆菌抗噬菌体性状突变 不是由于环境因素 噬菌体诱导出来的 而是在它们接触噬菌体前 在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的 解释 噬菌体在这里仅起到淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用 Newcombe的涂布实验 1949 固体平板培养法 2 涂布试验 1949年 Newcombe 结果 在涂布过的一组中 共有抗性菌落353个 要比未经涂布过的 仅28个菌落 高得多 这也意味着该抗性突变株发生在未接触噬菌体前 噬菌体的加入只起到甄别这类突变是否发生的作用 而不是诱导突变的因素 解释 平板影印 replicaplating 1952 Lederberg夫妇 实验表明 从未接触链霉素 str 的菌株可发生抗性突变 分离可得到纯的strr菌株 一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法 1次接8个 1952年 莱德伯格 Lederberg 夫妇设计了一种更巧妙的影印培养试验 直接证明了微生物抗药性是自发产生的 并与相应的环境因素毫不相干 以上三个实验充分说明了抗性突变是菌体接触所抗物质以前就已经自发产生了 药物并不是诱变因素 含药物的环境只起筛选和鉴别抗性菌株的作用 即使不存在链霉素 抗链霉素的突变株仍然存在 结论 3 基因突变的机理与菌种的选育 碱基置换 由于某种化学诱变剂的作用 使DNA分子中一对碱基被另一对碱基所取代 移码突变 指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添 插入 或缺失 从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变 碱基置换 a 转换 DNA链中原有的一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 或一个嘌呤被另一个嘌呤所置换 b 颠换 DNA链中原有的一个嘧啶被一个嘌呤所置换 或一个嘌呤被一个嘧啶所置换 正常DNA链上的三联密码子 第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子 在第二个密码子上缺失一个碱基A后引起的变化 移码突变 3 1诱发突变的机理 诱变剂 能显著提高突变的几率的物理或化学因子称为诱变剂 诱变剂的种类很多 作用的方式也多种多样 但其最终都通过改变遗传物质的结构而导致突变的发生 诱变剂作用于微生物细胞后可产生不同的诱变效应 有些诱变剂能产生多种诱变效应 3 1 1辐射类诱变 很多波长较短地射线 如紫外线 x射线 射线以及快中子等都有强烈地诱变作用 其中最有效地是波长为260nm左右地紫外线 紫外线作用于DNA引起结构的变化 DNA链的断链DNA分子内和分子间产生交联作用核酸和蛋白质产生交联作用形成嘧啶水合物和嘧啶二聚体 链内或链间 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体 光复活作用 经紫外线照射后的微生物暴露于可见光下时 可明显的降低其死亡率的现象 切割修复作用 不需要可见光的作用 可以修复因形成嘧啶二聚体或因碱基错配等引起的多种DNA损伤 对紫外线诱变的修复 切割修复作用 3 1 2碱基类似物诱变剂 诱变物质通过代谢渗入到DNA分子中去间接地引起碱基对的转换 诱发这类变异的化学物质主要是一些碱基的类似物 例如5 BU 3 1 2碱基类似物诱变剂 5 BU A T A BUk 酮式 G BUe 烯醇式 A T A BUk G C G BUe G C G C A BU G C A T A BU A T A T G C A T G C 3 1 3引起DNA碱基发生化学变化的诱变剂 直接与DNA分子中碱基发生化学反应 改变这些碱基的性状 使DNA在下一轮的复制中出现错误配对现象 例如 亚硝酸 氧化脱氨作用 G C G U A U A U A T C H T H T A C H C G G C G C T A T A A T C G 第三节微生物的基因重组 基因重组 是指遗传物质的重排 也即DNA双螺旋直接发生遗传物质的交换 原核微生物转化转导接合真核微生物有性杂交准性杂交 1 原核微生物 1 1转化 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段 通过交换 把该DNA片段组合到自己的基因组中 获得了供体菌的部分遗传性状的现象 1 作为转化过程中的受体菌 可以在其细胞壁上吸附外源DNA 可以使吸附的外源DAN进入细胞 细胞内不存在破坏外源DNA的酶 具备将外来的DNA进行重组的酶系统 2 用于转化的外源DNA 必须具有较高的分子量 但又不能太大 完整的双螺旋结构 在受体菌周围环境中呈可溶的状态 降解 吸附 切割成4 5 106 单链入胞 同源部分配对 整合 复制分裂 只有一个子代DNA分子获得供体基因 3 转化作用的过程一般是 1 2转导 转导 以噬菌体为载体 将供体菌的部分DNA传递给受体菌的过程 需要注意的是 由于噬菌体与其宿主细胞间具有特异性 供体菌和受体菌必须是同种细菌 普遍性转导局限性转导 1 普遍性转导 此类转导噬菌体的蛋白质外壳误包供体菌的DNA片断具有随机性 传递的基因可以是供体菌染色体的任何一部分 2 局限性转导 2 局限性转导 1 3接合 接合 是指供体菌与受体菌的完整细胞之间直接接触 并通过特殊的附属物而传递大段DNA的过程 细菌的结合作用主要出现在革兰氏阴性细菌中 目前研究最清楚的是大肠杆菌 F因子指细胞内1 4个非核的 独立的环状双链DNA单位 具有自主复制以及转移到其他细胞中能力 F 菌株 含有F因子的大肠杆菌 其细胞表面有性菌毛 是F因子指导合成的 可以用来传递F因子 F 菌株 与F 菌株相对应的受体菌则不含F因子 2 真核微生物的基因重组 有性杂交准性杂交 1 自发突变与自然选育 在没有人为因素参与的自然条件下 微生物细胞群体能以一定的频率 通常在10 4 10 11之间 产生随机突变体 微生物自身代谢产物的诱变效应互变异构效应 第四节微生物的菌种选育 2 诱变育种 诱变育种 利用物理和化学诱变剂对微生物细胞群体进行适当的处理 使之发生基因突变 并用有效的方法从诱变后的群体中选出优良正突变体 这就是诱变育种 诱变育种的一般步骤和方法出发菌株同步培养使菌细胞处于相同或接近的生理状态单细胞 或单孢子 菌悬液的制备单细胞或单孢子的意义酵母或霉菌孢子106 ml 细菌108 ml诱变剂的选择及其剂量的确定以致死率为90 99 为宜诱变处理 物理诱变剂 化学诱变剂 确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定同步培养 制备单细胞 或单孢子 悬液 活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异的菌落数 计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法重复筛选 摇瓶发酵试验选出突变体 根据情况进行生产试验或重复诱变处理 微生物的诱变育种 2 1选择出发菌株 出发菌株指的是用于进行诱变育种的原始菌株 从自然界中直接分离出的野生型菌株生产中筛选出来的自然突变菌株诱变处理过的突变菌株 2 2选择诱变剂与诱变剂量 通常诱变剂的选择 根据经验以及使用的方便与否来选择所使用的诱变剂 在辐射类诱变剂中 紫外线是最常使用的 在化学诱变剂中 硫酸二乙酯 甲基磺酸二乙酯 亚硝基胍等通常效果较好 2 2选择诱变剂与诱变剂量 确定诱变剂量 需要考虑多种因素 如诱变剂的种类 处理方式 菌种对诱变剂的敏感程度 菌种的变异特性等 由于各种诱变剂的剂量单位不同 常采用杀菌率来表示各种诱变剂的的相对剂量 2 3诱变菌的准备和诱变处理 诱变菌的准备 进行诱变处理之前 一般要先用无菌水将待诱变的菌株制成菌悬液 并使菌悬液中的菌体尽量呈分散的单个细胞状 诱变处理 根据诱变剂的特性来调整 2 4筛选高产突变菌株 由于经过诱变处理的菌株中 发生突变的菌株所占的比例很小 只占存活细胞的百分之几或更少 而发生正突变的菌株所占的比例更小 因此 必须借助于一些简便而有效的手段进行筛选 2 4筛选高产突变菌株 初筛 淘汰大量的负突变株 减轻复筛的工作量 对生产性能测定的准确性要求较低 方法也尽可能地简单易行 复筛 要求比较精确地测定方法对有关生产性能进行测定 所使用地培养方法也要尽可能符合实际生产工艺 二 微生物的诱变育种 变异菌株的初步筛选 纸片培养显色法 透明圈法 琼脂块培养法 常见的微生物突变类型 1 营养缺陷型 auxotroph 一种缺乏合成其生存所必须的营养物 包括氨基酸 维生素 碱基等 的突变型 只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物 precursor 才能生长 营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段 表型判断的标准 在基本培养基上能否生长 表型 基因型 在选择培养基 一般为基本培养基 上不生长 负选择标记 突变株不能通过选择平板直接获得 营养缺陷型 auxotroph 特点 营养缺陷型的表示方法 表现型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC 组氨酸缺陷型 其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变 基因型 同上 但第一个字母大写 且不用斜体 HisC 在具体使用时多用hisC 和hisC 分别表示缺陷型和野生型 营养缺陷型 auxotroph 影印平板 Replicaplating 法是Lederberg夫妇在1952年建立 2 抗药性突变型 resistantmutant 基因突变使菌株对某种或某几种药物 特别是抗生素 产生抗性 特点 正选择标记 突变株可直接从抗性平板上获得 在加有相应抗生素的平板上 只有抗性突变能生长 所以很容易分离得到 表示方法 所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上 r 表示strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性 3 条件致死突变型 conditionallethalmutant 在某一条件下具有致死效应 而在另一条件下没有致死效应的突变型 常用的条件致死突变是温度敏感突变 用ts temperature sensitive 表示 这类突变在高温下 如42 是致死的 但可以在低温 如25 30 下得到这种突变 特点 负选择标记 这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因 4 形态突变型 morphologicalmutant 造成形态改变的突变型 特点 非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长 但可从形态特征上进行区分 举例 产蛋白酶缺陷突变株的筛选 菌落颜色变化 半乳糖苷酶基因的插入失活 使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开 形成芽孢缺陷菌株 细胞水平上的形态突变 突变株的检出更加困难 5 其它突变类型 毒力 生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测到的表型 其突变株的获得往往需要较大的工作量 3 原生质体融合 3 原生质体的融细胞杂交 4 体外重组DNA技术 1 常用的菌种保藏方法 菌种保藏的一般原理 根据不同的微生物的代谢特点 人工地创造某些条件 使微生物的代谢