大肠杆菌,枯草杆菌,地衣芽孢杆菌以及酵母的感受态制备及转化.doc

地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化条件探索及优化见文献。接种新鲜Bacillus licheniformis 2709单菌落至10mL芽孢杆菌基本培养基中，37 剧烈振荡培养1618 h，250 r/min，培养至OD600为1.0时，取1.5 mL该培养液加入到10 mL 37 水浴预热的40 mL新鲜芽孢杆菌基本培养基中。37剧烈振荡培养4 h，250 r/min。加入 10 mL芽孢杆菌饥饿培养基，37剧烈振荡培养4 h，250 r/min。将细菌在冰水浴冷却15 min，分装于0.5 mL Eppendorf 管中，于4 10000 r/min 离心10 min ，沉淀用预冷的水轻轻溶解悬浮，可直接进行实验，也可于-70冻存。将新鲜制备的转化前细胞0.5 mL在4 10000r/min下离心10 min，弃上清，加入0.5 mL 冰水悬浮，如此反复洗涤细胞三次，轻柔操作，冰浴10 min分别加入不同浓度的质粒DNA，混匀，将溶液转移到预冷的无菌电转化池中，吸干池表面的水分，将电转化池放入电转仪的样品槽中，在电场强度为25F、不同的电压下电击转化。迅速取出电转化池，加入1 mL BY液体培养基稀释细胞，37 水浴摇床培养1.5 h，取200 l涂布于LB固体卡那霉素抗性平板上，37 培养。阳性转化子的筛选 将阳性转化子点种于酪素固体卡那霉素抗性平板上筛选，观察透明圈。以地衣芽孢杆菌为宿主进行电转化 研究转化首先要考虑宿主细胞的感受态的形成能力，对于大肠杆菌为宿主细胞，经过CaCl2处理以后可以使大肠得到较好的感受态性能，可使每微克质粒转化得到107个转化子，而对于革兰氏阳性菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌要使其经过特殊处理得到较好的感受态性能并非易事，因为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在感受态细胞形成和DNA转化的机制上有很大的不同，目前有关机理还知道得很少，所以使用于处理革兰氏阴性菌的方法并不适用于革兰氏阳性菌7。然而在工业生物技术的研究和应用中，十分需要以分泌型革兰氏阳性菌为宿主的菌株，这对产品的后提取和精制很有意义，特别是在以基因工程手段进行的新菌种的构建过程中更是十分必要。在细菌中能够形成感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且细菌处于感受态是短暂的，肺炎双球菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等是这类菌。一般认为感受态是在细菌生长对数后期产生的。诸多研究表明，芽孢杆菌在营养缺乏的饥饿状态下，细胞易产生感受态因子，处于生长芽孢时期的芽孢杆菌更容易产生感受态89。作者在实验中正是基于此原则利用芽孢杆菌极限营养培养基使地衣芽孢杆菌处于产生感受态因子的状态，并结合电转化，同时探索了影响电转化效率的有关参数10。根据摸索的条件，将浓度为1.5 g/mL的整合质粒在1750 V、电场强度为25F下对诱导型感受态细胞成功地进行了电转化。将电转化所得到的转化子进行挑选，点种转移至酪素固体卡那霉素抗性平板上筛选，37 培养12 h，可以观察到这些转化子周围均产生明显透明圈，如图4-2所示，说明整合型质粒pAPR1成功转化入宿主细胞，并将碱性蛋白酶基因插入到宿主染色体中成功表达，转化子均为阳性克隆子。枯草杆菌化学感受态制备及转化方法试剂枯草杆菌化学感受态制备及转化方法 l 试剂 SPII Salts Solution：（500g Solution） 0.4(NH4)2SO4 0.2g 2.8%K2HPO43H2O1.4g 1.2%KH2PO4 0.6g 0.2%Trisodium Citrate Dihydrate0.1g 121灭菌20min SPIII Salts Solution：（500g Solution） 0.04%MgSO47H2O0.02g 121灭菌20min 100 CAYE Solution：（100g Solution） 2 Casamino acid 2g 10 Yeast Extract 10g 121灭菌20min SPI Medium：（20mL） 9.8mLSPII Salts Solution 9.8mLSPIII Salts Solution 200L （1V）Glucose（50W，115灭菌20min） 200L （1V）100 CAYE SPII Medium：（6mL） 5.88mL SPI Medium 60L （1V）50mM CaCl2 60L （1V）250mM MgCl2 100EGTA Solution：10mmolL EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0 l 工具：（以下物品均需灭菌） 50mL离心管，1.5mL离心管，5mL枪头，1mL枪头 ，200L枪头，20L枪头，空的10mL试管，纱布，涂布棒 l 方法 1、 前一天晚上挑取宿主菌接种于3mL 液体培养基中，37摇床培养过夜。 2、 第二天早上从过夜培养物中取100L菌液，接种至用50mL 离心管配好的5mL SPI Medium中，37摇床培养，3hr后开始测OD 600，当培养物生长到对数末期时约4.5小时，快速取200L接种到2mL SPII Medium中，于37100rpm摇床培养1.5hr。 3、 加20L 100EGTA溶液，于37100rpm摇床培养10min，用1.5mL离心管分装成500L每管。 4、 向管中加入适量的质粒，轻轻混匀于37100rpm摇床培养30min。 5、 将离心管转移到250rpm摇床，37培养1.5hr。 6、 以4000rpm离心收集菌体，弃部分上清液，留100L重悬菌体，涂相应的选择性平板，37过夜培养。 大肠杆菌感受态制备及转化一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右。 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4下3000g离心10分钟。2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、 感受态细胞分装成200l的小份,贮存于-70可保存半年。 三、 转化 1、从-70冰箱中取200l感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10l),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 3、42水浴中热击90秒或37水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养16-24小时。酵母感受态制备:试剂:1）1M 山梨醇2）YPD培养基:10g/l酵母膏20g/l蛋白胨20g/L葡萄糖3）MD固体培养基：13.4 g/L YNB，4x10-4 g/L 生物素，20 g/L葡萄糖，15 g/L 琼脂注：YNB配方见下面接种表达菌株P.pastoris GS115 (his-mut+)于50ml YPD培养基中，28-30，300rpm摇床培养至OD600=1.6-1.8。5000rpm离心 5min,菌体沉淀分别用100ml冷无菌水、20ml冷无菌水和20ml 1M冰浴预冷的山梨醇各洗一次。每次洗后均在5000rpm离心 5min并收集菌体。最后将离心得到的菌体细胞用200l 1M冰浴预冷的山梨醇悬浮，即为电击感受态细胞