人外周血_T细胞CD107a的表达变化与细胞毒活性的关系.pdf

中国肿瘤生物治疗杂志 h t t p w w w b i o t h e r o r g C h i nJC a n c e r B i o t h e r J u n 2011 V o l 18 N o 3 DO I 10 3872 j i s s n 1007 385X 2011 03 012 基础研究 人外周血 T 细胞 C D 107a 的表达变化与细胞毒活性的关系 周忠海 陈复兴 吕小婷 张娟 孙蕾清 张磊 黄菲 解放军 第 97医院 中心实验室 江苏 徐州 221004 摘 要 目的 探讨人外周血 T 细胞体外诱导过程中 C D107a 的表达变化及其与 T细胞细胞毒活性的关系 方法 分离健康人外周血单个核细胞 p e r i p h e r a l b l o o dmo n o n u c l e a r c e l l s P B MC s 加入含有 I L 2和异戊烯焦磷酸 i s o p e n t e n y l p y r o p h o s p h a t e I P P 的培养基 体外诱导 T 细胞 分别在第 7 10 14天以流式细胞仪对培养的 T细胞进行鉴定 并同时检测其 C D 107a 穿孔素和颗粒酶 B 的表达 C C K 8试剂盒检测 T细胞对胰腺癌细胞 S W 1990的杀伤效应 采用 S P S S 13 0软件进 行 s p e a r m a n 相关分析 结果 在培养的第 7 10 14天 T C R阳性细胞分别为 60 31 3 84 66 45 4 25 70 99 4 66 C D 107a 穿孔素和颗粒酶 B的表达在 T 细胞培养第 7 10天达到峰值后呈下降趋势 第 7天与第 0天 相比差异有统计学意义 80 66 4 42 70 11 3 34 94 26 4 25 v s 69 02 5 04 62 31 4 66 53 62 3 69 P 0 05 培养第 7天 第 10天的 T细胞对 S W 1990细胞杀伤率显著高于第 14天的 T细胞 58 86 5 12 61 53 4 69 v s 40 31 4 83 P 0 05 T 细胞 C D107a 表达与穿孔素 颗粒酶 B 其对 S W 1990细胞杀伤效应显著相关 r 0 853 r 0 785 r 0 839 均 P 0 01 结论 人外周血 T细胞 C D 107a 的表达与其抗 肿瘤能力正相关 可能是 T细胞细胞毒活性的一个标志 关键词 T细胞 C D107a 胰腺肿瘤 细胞毒作用 穿孔素 颗粒酶 B 中图分类号 R735 9 R 392 1 文献标志码 A 文章编号 1007 385X 2011 03 0301 05 基金项目 南京军区医学科技创新基金资助项目 N o 08M A 040 P r o j e c t s u p p o r t e db yM e d i c a l S c i e n c ea n dT e c h n o l o g yI n n o v a t i o nR e s e a r c h F o u n d a t i o no f N a n j i n g M i l i t a r yA r e a C o m m a n d N o 08M A 040 作者简介 周忠海 1973 男 硕士 主治医师 主要从事肿瘤细胞免疫治疗方面的研究 E m a i l z h o u z h o n g h a i 298 y a h o o c o m c n 通信作者 陈复兴 C H E NF u x i n g c o r r e s p o n d i n g a u t h o r E m a i l c h e n f u x i n g t i t c 163 c o m R e l a t i o n s h i po f C D 107ae x p r e s s i o nw i t hc y t o t o x i ca c t i v i t yo f h u m a np e r i p h e r a l Tc e l l s Z H O UZ h o n g h a i C H E NF u x i n g L VX i a o t i n g Z H A N GJ u a n S U NL e i q i n g Z H A N GL e i H U A N GF e i C e n t r a l L a b o r a t o r y N o 97 H o s p i t a l o f P L A X u z h o u221004 J i a n g s u C h i n a A b s t r a c t Ob j e c t i v e T oi n v e s t i g a t ec h a n g e s o f C D 107ae x p r e s s i o ni n Tc e l l s d u r i n gc u l t i v a t i o na n dt h er e l a t i o n s h i p o f C D 107ae x p r e s s i o nw i t hc y t o t o x i c i t yo f Tc e l l s Me t h o d s Tc e l l s w e r eg e n e r a t e di nv i t r ob ys t i m u l a t i n gP B M C s w i t hI L 2 a n di s o p e n t e n y l p y r o p h o s p h a t e I P P P h e n o t y p e a n a l y s i s o f Tc e l l s w a s p e r f o r m e do nt h e7 10 a n d14 d a y b yf l o wc y t o m e t r y M e a n w h i l e C D 107a p e r f o r i na n dg r a n z y m e Be x p r e s s i o n s w e r e d e t e c t e di n Tc e l l s b yf l o wc y t o m e t r y T h ec y t o t o x i c i t yo f Tc e l l s o np a n c r e a t i cc a r c i n o m aS W 1990 c e l l s w a s d e t e r m i n e db y C C K 8 k i t S p e a r m a n c o r r e l a t i o na n a l y s i s w a s p e r f o r m e db yS P S S 13 0 s o f t w a r e R e s u l t s T C Re x p r e s s i o ni n Tc e l l sw a s 60 31 3 84 66 45 4 25 a n d 70 99 4 66 o n7 10 a n d14 d a y r e s p e c t i v e l y T h ee x p r e s s i o no f C D 107a p e r f o r i na n d g r a n z y m eBr e a c h e dt h ep e a ko n7 10 d 7 dv s 0 d 80 66 4 42 70 11 3 34 94 26 4 25 v s 69 02 5 04 62 31 4 66 53 62 3 69 P 0 05 a n dt h e ng r a d u a l l y d e c r e a s e d T h ec y t o t o x i c i t y r a t e s o f 7 d a ya n d10 d a y Tc e l l sa g a i n s tS W 1990 c e l l sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo f 14 d a y Tc e l l s 58 86 5 12 61 53 4 69 v s 40 31 4 83 P 0 05 C D 107a e x p r e s s i o ni n Tc e l l s w a s s i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e dw i t hp e r f o r i n g r a n z y m eBe x p r e s s i o n s a n dc y t o t o x i c i t y o nS W 1990 c e l l s P 0 01 C o n c l u s i o n T h e e x p r e s s i o no f C D 107ao nh u m a np e r i p h e r a l Tc e l l si sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hi t s a n t i t u m o r e f f e c t a n dm a ys e r v e a s a m a r k e r f o r t h ec y t o t o x i ca c t i v i t yo f Tc e l l s Ke yw o r d s Tc e l l C D 107a p a n c r e a t i cc a r c i n o m a c y t o t o x i c i t y p e r f o r i n g r a n z y m eB C h i nJ C a n c e r B i o t h e r 2011 18 3 301 305 301 中国肿瘤生物治疗杂志 2011年 6月 18 3 T 细胞是 T 淋巴细胞中表达 T C R 的一个 独特亚群 约占外周血 T 淋巴细胞的 1 5 1 在机体的抗感染 抗肿瘤和免疫监视等方面起到重 要的作用 许多研究 2 7 表明 体外培养扩增的 T 细胞具有较强的抗肿瘤活性 是过继性免疫治疗重 要的效应细胞 近来一些报道 8 9 提示 C D 107a 是 N K 细胞和 C D 8 T 细胞活化的一个重要标志 与细 胞毒活性密切相关 可作为 N K 和 C D 8 T 细胞功能 活性的指标 但是 C D 107a 与 T 细胞活化和功能 的关系未见报道 因此 本研究探讨 C D 107a 在体 外扩增的 T 细胞上的表达及其与 T 细胞细胞 毒活性的关系 为 C D 107a 作为 T 细胞活化和细 胞毒性的标志提供实验依据 1材料与方法 1 1 主要试剂和细胞株 重组人 I L 2购自厦门特宝生物工程公司 异戊 烯焦磷酸 i s o p e n te n y l p y r o p h o s p h a t e I P P 购自 S i g m a 公司 R P M I1640培养基 小牛血清购自 G i b c o 公 司 鼠抗人 F I T C 标记的 a n t i T C R 购自 B D 公司 P E 标记的 a n ti C D 3 P E标记的 a n t i p e r f o r i n P E 标 记的 a n ti g r a n z y m eB F I T C 标记的 a n t i C D 107a 购自 e B i o s c i e n c e 公司 F ix P e r m细胞破膜试剂盒购自 I n v i t r o g e n 公司 C C K 8试剂盒购自碧云天生物技术 公司 胰腺癌细胞株 S W 1990购自中国科学院上 海生命科学研究院细胞资源中心 C S 3000血细胞 分离机购自美国 B a x t e r 公司 流式细胞仪购自美国 B D 公司 C O2培养箱购自 H e r a e u s 公司 1 2 外周血 T 细胞的培养 应用 C S 3000血细胞分离机采集健康志愿者外 周血 经人淋巴细胞分离液梯度密度离心获得外周 血单个核细胞 用 P B S 洗涤 2次 悬浮于含 10 小 牛血清的 R P M I 1640培养基中 置 37 5 C O2培 养箱中孵育 2 h 收集未贴壁细胞并调整细胞密度至 1 10 6 m l 加入含 400 U m l I L 2 1 5 m o l LI P P 10 小牛血清及 5 自身血清的 R P M I 1640培养 基 置 37 5 C O2培养箱中培养 以后每 3 d 补 加含同样成分的新鲜培养基 1 3 流式细胞术鉴定 T 细胞的纯度 于培养的第 7 10 14 d 收集部分 T 细胞 用 P B S 洗涤 2次 计数细胞 用 P B S 调整细胞密度至 1 10 7 m l 取 100 l 细胞悬液 分别加入 20 l F I T C 标记的鼠抗人 a n t i T C R 和 P E 标记的鼠抗人 a n t i C D 3 室温避光孵育 15 m in P B S 洗涤 2遍 加入 300 l P B S 重悬细胞 流式细胞仪检测 T 细胞的 纯度 1 4 流式细胞术检测 T 细胞 C D 107a 穿孔素和 颗粒酶 B 的表达 于培养的第 7 10 14天收集部分 T 细胞 用 P B S 洗涤 2次 计数细胞 用 P B S 调整细胞密度为 1 10 7 m l 取 100 l 细胞悬液 加入 20 l F I T C 标 记的鼠抗人 a n ti T C R P E 标记的鼠抗人 a n t i C D 3 和 5 l A P C 标记的鼠抗人 a n ti C D 107a 室温避光孵 育 15 m i n P B S 洗涤 2遍 加入 300 l P B S 重悬细 胞 流式细胞仪检测 T 细胞中 C D 107a 的表达 另取 2管各 100 l 细胞悬液 加入 20 l F I T C 标记的鼠抗人 a n t i T C R和 P E标记的抗人 a n t i C D 3 室温避光孵育 15 m i n 每管中加入 100 l 破膜 试剂盒中的试剂 A 室温避光孵育 15 m i n P B S 洗涤 后每管中加入 100 l 破膜试剂盒中的试剂 B 同时 穿孔素 p e r fo r i n 测定管中加入 5 l P E 标记的抗人 a n ti p e r f o r i n 颗粒酶 B g r a n z y m eB 测定管中加入 20 l P E 标记的抗人 a n t i g r a n z y m e B 室温避光孵育 15 m i n P B S 洗涤 以 300 l P B S 重悬细胞 流式细 胞仪检测穿孔素 颗粒酶 B 的表达 1 5 C C K 8法检测 T 细胞对 S W 1990细胞的杀 伤活性 取对数生长期 S W 1990细胞作为靶细胞 以 1 10 4 孔的密度接种于 96孔板 于 37 5 C O2 培养箱中培养 48 h 后以 20 1 的效靶比加入培养 7 10 14 d 的 T 细胞 同时设空白对照组 效应细胞 对照组和靶细胞对照组 每组设 3个复孔 效应细 胞与靶细胞共培养 24 h 加入 C C K 8溶液 20 l 孔 37 孵育 2 h 后 酶联免疫分析仪在 450 n m波 长处检测每孔的 D 值 杀伤活性 1 实验 组 D 值 效应细胞对照组 D值 靶细胞对照组 D 值 100 1 6 统计学处理 数据采用 x s 表示 用 S P S S 13 0软件进行统 计分析 两样本间均数比较采用 t 检验 C D 107a 表 达与功能指标及杀伤效应相关关系的分析采用 s p e a r m a n 相关分析 P 0 05和 P 0 01表示差异 有统计学意义 2 结 果 2 1 外周血 T 细胞的鉴定 外周血 T 细胞的比例 在培 养的第 7 天 T C R 阳性细胞已经达到 60 31 3 84 第 10 天和第 14天时分别为 66 45 4 25 70 99 4 66 随着培养时间的延长 T 细胞的纯度呈 302 周忠海 等 人外周血 T 细胞 C D 107a 的表达变化与细胞毒活性的关系 逐渐增加的趋势 图 1 图 1 T细胞培养过程中 T C R表达的变化 F i g 1 C h a n g eo f T CRe x p r e s s i o no n Tc e l l sd u r i n gc u l t i v a t i o n 2 2 外周血 T 细胞培养过程中 C D 107a 穿孔素 和颗粒酶 B 的表达 第 0天 P B M C s 中 T 细胞 C D 107a 穿孔素和 颗粒酶 B 表达分别为 69 02 5 04 62 31 4 66 和 53 62 3 69 培养至 第 7 天 C D 107a 穿孔素和颗粒酶 B 的表达分别为 80 66 4 42 70 11 3 34 和 94 26 4 25 第 10天分别为 82 84 5 03 67 82 4 28 和 93 24 3 89 第 14天分别为 52 65 5 27 46 99 3 62 和 76 16 3 55 第 7 天与第 10天相比 差异没有统计学意义 但是均显 著高于第 0天和第 14天 差异有统计学意义 P 0 01 至第 14天 颗粒酶 B 表达虽有下降 但仍然 显著高于第 0天 P 0 01 C D 107a 和穿孔素表达 明显减低 显著低于第 0 天 差异有统计学意义 P 0 01 图 2 图 2 T细胞培养过程中 CD107a 穿孔素 和颗粒酶 B的表达变化 F i g 2 C h a n g e so f CD107a p e r f o r i na n dg r a n z y me Be x p r e s s i o n s i nc u l t u r e d Tc e l l s P 0 01 v s0 do r14 d P 0 01 v s0d 2 3 不同培养时间的 T 细胞对 S W 1990细胞的 杀伤效应 培养第 7天的 T 细胞对胰腺癌 S W 1990细 胞的杀伤效率为 58 86 5 12 至第 10天达 61 53 4 69 但第 14天 T 细胞的杀伤效率 下降为 40 31 4 83 培养第 7天和第 10天的 T 细胞杀伤活性显著高于第 14天 P 0 01 2 4 T 细胞 C D 107a 穿孔素及颗粒酶 B 表达和 对 S W 1990细胞杀伤作用的相关性分析 采用 S P S S 13 0软件进行 S p e a r m a n 相关分析 T 细胞 C D 107a 表达与穿孔素表达显著相关 r 0 853 P 0 01 图 3A 与颗粒酶 B 表达显著相关 r 0 785 P 0 01 图 3B 同 时 T细胞 C D 107a 表达与对其对 S W 1990细胞杀伤能力也显 著相关 r 0 839 P 0 01 图 3C 图 3 C D107a 表达与 T细胞相关功能指标的相关性分析 F i g 3 C o r r e l a t i o na n a l y s i sb e t we e nCD107ae x p r e s s i o n a n df u n c t i o n a l r e a d o u t so f Tc e l l s A C o r r e l a t i o nb e t w e e nC D107aa n dp e r f o r i o n B C o r r e l a t i o nb e t w e e nC D107aa n dg r a n z y m eB C C o r r e l a t i o nb e t w e e nC D107aa n d c y t o t o x i c i t yo f Tc e l l s 303 中国肿瘤生物治疗杂志 2011年 6月 18 3 3 讨 论 T 细胞是机体重要的固有免疫细胞 同时是 固有免疫和适应性免疫的桥梁 10 11 能以 M H C 非 限制性的方式识别非肽类抗原如甲羟戊酸途径来源 的 I P P 12 和唑来膦酸 帕米膦酸等磷酸抗原 13 14 在肿瘤免疫监视和免疫治疗中起到重要的作用 近 年来 T 细胞在恶性胶质瘤 骨髓瘤 淋巴瘤 胃肠 道肿瘤 非小细胞肺癌 肾细胞癌等肿瘤体外研究 动物模型及临床研究中 其过继性免疫治疗作用得 到了广泛的认可 成为肿瘤细胞免疫治疗重要的效 应细胞 2 7 然而 对于体外培养诱导的 T 细胞 的功能活性检测尚缺乏简单的方法 A l t e r 等 8 研究表明 C D 107a 和细胞因子分泌 与 N K 细胞介导的靶细胞裂解存在着相关关系 可 作为 N K 细胞功能活性的标志 A k t a s 等 9 检测了 各种刺激后 N K 细胞和 C D 8 T 细胞上 C D 107a 的表 达 同时以 K 562细胞作为靶细胞进行细胞毒活性 检测 结果证明 C D 107a 是 N K 细胞毒活性检测的 一个灵敏指标 因此 本研究就 T 细胞在体外培 养扩增过程中 C D 107a 的表达进行动态检测 观察 其能否作为 T 细胞活化后细胞毒功能的一个指 标 随着培养时间的延长 T 细胞得到迅速增殖 细胞纯度不断提高 但 T 细胞对胰腺癌细胞 S W 1990的杀伤效应并非随之持续增强 这表明并非 T 细胞纯度越高其杀伤活性越强 其真实的细胞 毒活性还需要其他相关功能指标来反映 穿孔素和颗粒酶 B 是 T 细胞重要的效应分 子 穿孔素是存在于 C T L N K 细胞和 T 细胞胞质 中的细胞毒颗粒 能以钙离子依赖方式在靶细胞膜 上形成跨膜通道 导致靶细胞渗透性溶解 15 颗粒 酶 B 是 C T L 和 N K 细胞颗粒中最重要的丝氨酸蛋白 酶 通过 c a s p a s e 依赖途径 直接入核途径及不依赖 c a s p a s e 的胞质途径杀伤靶细胞 16 通过释放穿孔 素和颗粒酶裂解靶细胞为 T 细胞杀伤靶细胞的 主要机制 17 20 因此 穿孔素和颗粒酶 B 是 T 细 胞重要的细胞毒效应功能指标 本研究采用流式细 胞术分析 T 细胞中穿孔素和颗粒酶 B 的表达变 化 以 C D 3 T C R 细胞群设门 排除了 I L 2诱导 下其他细胞如 N K 细胞的干扰 研究显示 体外诱 导培养过程中 T 细胞功能指标穿孔素和颗粒酶 B 的表达在 7 10 d 达到峰值后呈现下降的趋势 与 C D 107a 的表达显示显著的相关性 C D 107a 表达和 对肿瘤细胞 S W 1990的杀伤效应相关性分析同样 说明 C D 107a 的表达与其细胞毒活性显著相关 以 上相关性分析均证明了 C D 107a 可作为 T 细胞细 胞毒活性的一个功能标志 与传统的细胞内细胞因子分析 51 C r 释放测定 和 L D H释放测定等方法相比 C D 107a 检测更为灵 敏和简单方便 是分析 T 细胞功能活性的简单方 便的方法 因此 作为 T 细胞的细胞毒活性标 志 C D 107a 可能会成为 T 细胞在肿瘤细胞过继性 免疫治疗中功能鉴定的重要指标 参 考 文 献 1 P u a nK J L o wJ S T a n T W e t a l P h e n o t y p i c a n d f u n c t i o n a l a l t e r a t i o n s o f V g a m m a 2V d e l t a 2 Tc e l l s u b s e t si np a t i e n t sw i t ha c t i v e n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a J C a n c e rI m m u n o lI m m u n o t h e r 2009 58 7 1095 1107 2 K o b a y a s h i H T a n a Y Y a g i J e t a l S a f e t y p r o f i l e a n d a n t i t u m o r e f f e c t s o fa d o p t i v ei m m u n o t h e r a p yu s i n gg a m m a d e l t aTc e l l sa g a i n s t a d v a n c e d r e n a l c e l l c a r i c i n o m a Ap i l o r s t u d y J C a n c e r I m m u n o l I m m u n o t h e r 2007 56 4 469 476 3 Y u a s a T S a t o K A s h i h a r a E e t a l I n t r a v e s i c a l a d m i n i s t r a t i o no f g a m m a d e l t aTc e l l ss u c c e s s f u l l yp r e v e n t st h eg r o w t ho fb l a d d e r c a n c e r i nt h em u r i n em o d e l J C a n c e r I m m u n o l I m m u n o t h e r 2009 58 4 493 502 4 B e c k B H K i mH G K i mH e t a l A d o p t i v e l y t r a n s f e r r e de xv i v o e x p a n d e d g a m m a d e l t a Tc e l l s m e d i a t ei nv i v o a n t i t u m o r a c t i v i t y i n p r e c l i n i c a l m o u s em o d e l s o f b r e a s t c a n c e r J B r e a s t C a n c e r R e s T r e a t 2010 122 1 134 145 5 M u r a y a m aM T a n a k aY Y a g i J e t a l A n t i t u m o r a c t i v i t ya n d s o m e i m m u n o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f T c e l l s f r o mp a t i e n t s w i t hg a s t r o i n t e s t i n a l c a r c i n o m a s J A n t i c a n c e r R e s 2008 28 5B 2921 2931 6 K a n g N Z h o u J Z h a n g T e t a l A d o p t i v e i m m u n o t h e r a p y o f l u n g c a n c e r w i t hi m m o b i l i z e da n t i T C Rg a m m a d e l t aa n t i b o d y e x p a n d e d h u m a ng a m m a d e l t a T c e l l s i np e r i p h e r a l b l o o d J C a n c e r B i o l T h e r 2009 8 16 1540 1549 7 K o b a y a s h i H T a n a k a Y S h i m m u r a H e t a l C o m p l e t e r e m i s s i o n o f l u n g m e t a s t a s i s f o l l o w i n ga d o p t i v ei m m u n o t h e r a p yu s i n ga c t i v a t e d a u t o l o g o u s T c e l l si nap a t i e n t w i t hr e n a l c e l l c a r c i n o m a J A n t i c a n c e r R e s 2010 30 2 575 579 8 A l t e r G M a l e n f a n t J A l t f e l d M C D 107a a s a f u n c t i o nm a k e r f o r t h ei d e n t i f i c a t i o no f n a t u r a l k i l l e r c e l l a c t i v i t y J JI m m u n o l M e t 2004 294 1 2 15 22 9 A k t a s E K u c u k s e z e r U C B i l g i cS e t a l R e l a t i o n s h i pb e t w e e n C D 107ae x p r e s s i o na n dc y t o t o x i ca c t i v i t y J C e l l I m m u n o l 2009 254 2 149 154 10 C a r d i n g S R E g a nP J G a m m a d e l t aTc e l l s F u n c t i o n a l p l a s t i c i t y a n d h e t e r o g e n e i t y J N a t R e v I m m u n o l 2002 2 5 336 345 11 G i r a r d i M I m m u n o s u r v e i l l a n c e a n di m m u n o r e g u l a t i o n b y g a m m a d e l t a Tc e l l s J J I n v e s t D e r m a t o l 2006 126 1 25 31 12 A l e x a n d e r A A M a n i a r A C u m m i n g s J S e t a l I s o p e n t e n y l p y r o p h o s p h a t e a c t i v a t e d C D 56 Tl y m p h o c y t e s d i s p l a yp o t e n t a n t i t u m o r a c t i v i t y t o w a r dh u m a ns q u a m o u sc e l l c a r c i n o m a J C l i n 304 周忠海 等 人外周血 T 细胞 C D 107a 的表达变化与细胞毒活性的关系 C a n c e r R e s 2008 14 13 4232 4240 13 N o g u c h i A K a n e k oT K a m i g a k i T e t a l Z o l e d r o n a t e a c t i v a t e d V 9 Tc e l l b a s e d i m m u n o t h e r a p y i s f e a s i b l e a n d r e s t o r e s t h e i m p a i r m e n t o f Tc e l l s i n p a t i e n t s w i t hs o l i d t u m o r s J C y t o t h e r a p y 2011 13 1 92 97 14 T h o m p s o n K R o e l o f s A J J a u h i a i n e n M e t a l A c t i v a t i o n o f g a m m a d e l t aTc e l l sb yb i s p h o s p h o n a t e s J A d vE x pM e dB i o l 2010 658 11 20 15 U r r e a M R G i l J R o d r i g u e z S a i n z C e t a l F u n c t i o n a l a s s e s s m e n t o f p e r f o r i nC 2 d o m a i n m u t a t i o n s i l l u s t r a t e s t h e c r i t i c a l r o l e f o r c a l c i u m d e p e n d e n t l i p i db i n d i n gi np e r f o r i nc y t o t o x i cf u n c t i o n J B l o o d 2009 113 2 338 346 16 P r a k a s hM D B i r dC H B i r dP I A c t i v ea n dx y m o g e nf o r m so f g r a n z y m e Ba r e c o n s t i t u t i v e l y r e l e a s e d f r o mc y t o t o x i c l y m p h o c y t e s i n t h e a b s e n c eo f t a r g e t c e l l e n g a g e m e n t J I m m u n o l C e l l B i o l 2009 87 3 249 254 17 V i e yE F r o m o n t G E s c u d i e r B e ta l P h o s p h o s t i m a c t i v a t e d g