（细胞生物学专业论文）胃癌细胞mgc803中mir200a作用机制的初步研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语8 三、论文 前言”9 刖吾” 实验材料与方法1 0 实验结果( 附论文图片) l7 讨论2 l 结论2 3 四、本研究创新性的自我评价2 4 五、参考文献2 5 六、附录 综述2 7 在学期间科研成绩j 3 6 致谢3 7 个人简介3 8 中文论著摘要 胃癌细胞m g c 8 0 3 中m i r - 2 0 0 a 作用机制的初步研究 刖吾 胃癌是源自胃粘膜上皮的恶性肿瘤，在我国发病率及死亡率很高。胃癌涉及 到多种癌基因的激活及抑癌基因的失活，揭示这些基因变化的规律，不仅可以阐 明癌变的机制，更可以协助肿瘤的诊断、治疗和预后。近年来，m i r n a 分子对基 因表达的调控作为肿瘤发生发展的又一可能原因，受到越来越多的关注。 m i c r o r n a s 是长约2 1 2 5 个核苷酸的d 、r n a 分子，在真核生物中发挥基因表 达调控作用，通过调节肿瘤相关基因的表达，参与肿瘤的发生发展。 本实验室前期利用多重连接依赖式探针扩增( m u l t i p l e xl i g a t i o n d e p e n d e n t p r o b ea m p l i f i c a t i o n , m l p a ) 技术对5 0 例胃癌组织进行基因组水平的分析，发现有 5 8 的病例存在染色体l p 3 6 1 叉域的缺失，提示该区域可能存在胃癌特异性的抑制 基因或调控序列。人类m i r 2 0 0 a 定位于染色体l p 3 6 区，在乳腺癌、卵巢癌及结肠 癌细胞中己证实m i r 2 0 0 a 通过抑制转录因子z e b 2 的表达，间接调节e c a d h e f i n 的 表达，抑制肿瘤细胞的迁移，抑制上皮向问质转化( e p i t h e l i a lt om e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n , e m t ) ，但在胃癌中m i r - 2 0 0 a 的作用及可能的作用途径尚不清楚。 e - c a d h e r i n 是细胞粘附分子c a d h e r i n 家族成员，对于上皮的形成和维持具有重要作 用，其功能缺失与肿瘤的侵袭和转移有关。有研究表明：e c a d h e n n 参与调控 e p h a 2 与其配体的结合及后续降解，e p h a 2 1 拘功能活化也依赖于适当的e c a d h e r i n 蛋白表达及功能定位。e p h a 2 在许多肿瘤组织中呈过度表达，尤其高表达于高侵 袭性的肿瘤细胞。新近研究发现e p h a 2 在胃癌组织中高表达，且与胃癌的侵袭和 淋巴转移相关。 本研究以胃癌m g c 8 0 3 细胞为研究对象，试图探讨胃癌中m i r - 2 0 0 a 的作用 及可能参与的信号途径，以期为胃癌发生发展的研究提供一定的实验依据。 材料与方法 1 、化学合成的m i r 2 0 0 a 及相应阴性对照( n e g a t i v ec o n t r o l ，n c ) m i m i c s m i r - 2 0 0 a ：5 u a a c a c u g u c u g g u a a c g a u gu - 3 ： n e g a t i v ec o n t r o l ：5 - u u c u c c g a a c g u g u c a c g u t t - 3 2 、m i r - 2 0 0 a 及n c 转染m g c 8 0 3 细胞，使m i r - 2 0 0 a 过表达，应 用s t e a m 1 0 0 pr t p c r 检测转染后表达效率。 3 、转染m i r n am i m i c s2 4 及4 8 h ，利用t r i z o l 法提取总r n a ， 反转录合成c d n a ，应用实时定量r t - p c r 检测z e b 2 、e c a d h e r i n 、 h a 2 的m r n a 表达。 4 、转染m i r n am i m i c s2 4 及4 8 h ，应用w e s t e r nb l o t 方法检测 e c a d h e r i n 、e p h a 2 的蛋白表达。 5 、应用m g l 3 2 阻断蛋白降解，分析m i r - 2 0 0 a 对e p h a 2 降解的 调节。 实验结果 。 l 、m i r - 2 0 0 a 及n cm i m i c s 转染后表达效率的检测 经s t e a m 1 0 0 pr t p c r 检测，转染m i r 2 0 0 a 组中m i r - 2 0 0 a 的表达为转染n c 组的1 8 3 8 4 - 5 3 倍，表明m i r n a 片段转染后成功高效表达。 2 、胃癌细胞m g c 8 0 3 中m i r - 2 0 0 a 对z e b 2 表达的调节 m g c 8 0 3 细胞转染m i r - 2 0 0 a2 4h ，转染m i r 0 2 0 0 a 组z e b 2 的表达量为对照组 的o 7 倍；转染后4 8h ，转染m i r - 2 0 0 a 组z e b 2 的表达量为对照组的o 7 1 倍。 3 、胃癌细胞m g c 8 0 3 中m i r - 2 0 0 a 对e c a d h e r i n 表达的调节 m g c 8 0 3 细胞转染m i r 2 0 0 a2 4 及4 8 h ，转染m i r - 2 0 0 a 组e c a d h e r i n 表达均 高于对照组。在r n a 水平，实验组e c a d h e r i n 表达量约为对照组的2 3 8 1 、6 3 3 7 倍；在蛋白水平，实验组e c a d h e r i n 表达量约为对照组的1 5 7 、5 4 3 倍。 2 4 、胃癌细胞m g c 8 0 3 中m i r - 2 0 0 a 对e p h a 2 表达的调节 m g c 8 0 3 细胞转染m i r - 2 0 0 a2 4 h 后，转染m i r - 2 0 0 a 组e p h a 2 表达明显高于 对照组。在r n a 水平，实验组e p h a 2 表达量约为对照组的4 7 8 倍；在蛋白水平， 实验组e p h a 2 表达量约为对照组的3 4 倍。而4 8 h 后转染m i r - 2 0 0 a 组e p h 彳2 表 达略高于对照组。在r n a 水平，实验组e p h a 2 表达量约为对照组的1 3 9 倍。在 蛋白水平，实验组e p h a 2 表达量约为对照组的1 1 2 倍。 5 、m i r 2 0 0 a 可部分抵消m g l 3 2 介导的e p h a 2 降解抑制 蛋白酶体抑制剂m g l 3 2 可明显抑制e p h a 2 的降解，转染n c 的m g l 3 2 处理 组e p h a 2 的表达量约为对照组的2 8 3 倍；而转染m i r - 2 0 0 a 后，未见e p h a 2 明显 的降解抑制，m g l 3 2 的作用被部分抵消，使得m g l 3 2 处理组e p h a 2 的表达量约 为对照组的0 9 3 倍。 结论 1 、在胃癌细胞m g c 8 0 3 中，m i r - 2 0 0 a 通过抑匍j z e b 2 的表达，诱导e c a d h e r i n 的表达。 2 、在胃癌细胞m g c 8 0 3q b ，m i r 2 0 0 a 表达增加可导致转染后2 4 h ，e p h a 2 的表 达明显增加，而在4 8 h 这种表达增加不明显。 3 、m g c 8 0 3 细胞转染m i r - 2 0 0 a 及n c2 4 - - 4 8 h ，m i r - 2 0 0 a 激活t e p h a 2 的降解。 关键词 胃癌；m i r 2 0 0 a ；e p h a 2 ：e c a d h e r i n 3 英文论著摘要 p r e l i m i n a r ys t u d y o ft h em e c h a n i s mo fm i r 2 0 0 ai n g a s t r i cc a n c e rc e l ll i n em g c 8 0 3 i n t r o d u c t i o n g a s t r i cc a n c e ri sam a l i g n a n tt u m o rd e r i v e df r o mg a s t r i ce p i t h e l i u mw h i c hi s h i g h e ri nm o r b i d i t ya n dm o r t a l i t yi no u rc o u n t r y m u l t i s t e p sl e dt h eg e n ea l t e r a t i o na r e r e s p o n s i b l ef o rt h ed e v e l o p m e n to fc a n c e r i ti st h er e s u l to ft h ea c c u m u l a t i o no fg e n e a l t e r a t i o ni n v o l v i n gav a r i e t yo fo n c o g e n e sa n dt u m o rs u p p r e s s o rg e n e s t h e r e f o r e ， c l a r i f y i n g t h e u n d e r l y i n gm o l e c u l a rm e c h a n i s m i sf a v o r e df o ri m p r o v e m e n t so f p r e v e n t i o n , d i a g n o s i sa n dt r e a t m e n ti ng a s t r i cc a n c e r r e c e n t l y ，i ti s b e l i e v e dm i r n a p l a yai m p o r t a n tr o l e i nt h ep r o c e s so fg e n e se x p r e s s i o nr e g u l a t i o n a s o n eo ft h e r e a s o n s ，m i r n a sh a v ee a r n e dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n m i c r o r n a s ( m i r n a s ) a l es h o r tr n a m o l e c u l e sa b o u t21 - 2 5n u c l e o f i d el o n g ， a n dt h e ya r er e g u l a t o r so fg e n ee x p r e s s i o ni nav a r i e t yo fe u k a r y o t i co r g a n i s m s m i r n a s r e g u l a t e dm r n a s a s s o c i a t e d 、析n 1t u m o r s t h u sp a r t i c i p a t ei n t h ed e v e l o p m e n t o f t u m o r s o u rp r e v i o u ss t u d i e sa n a l y z e dt h eg e n o m i cl e v e lo f5 0p a t i e n t sw i t l lg a s t r i cc a n c e r t h r o u g hm l p at e c h n i q u e ，w ef o u n dt h a ti nlp 3 6r e g i o n , 58 o f t h ec a s e sh a dm i s s e d ， i n d i c a t i n gt h i sr e g i o nw a sc l o s e l yr e l a t e dt ot h ed e v e l o p m e n to fg a s t r i cc a n c e r h u m a n m i r - 2 0 0 al o c a t e di nc h r o m o s o m elp 3 6 i nb r e a s tc a n c e r , o v a r i a nc a n c e ra n dc o l o n c a n c e rc e l l s ，i th a db e e nc o n f i r m e dt h a tm i r - 2 0 0 ac a nr e g u l a t et h et r a n s c r i p t i o no f z e b 2 ，a n di n d i r e c t l yr e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fe c a d h e r i n ，i n h i b i tt u m o rc e l lm i g r a t i o n , i n h i b i te p i t h e l i a lt om e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n b u tt h ep a t h w a yi ng a s t r i cc a n c e rh a sn o t b e e nv e r i f i e d e c a d h e r i nw a sae e l la d h e s i o nm o l e c u l eo fc a d h e r i nf a m i l y , i th a da n i m p o r t a n tr o l ei nt h ef o r m a t i o na n dm a i n t e n a n c eo fe p i t h e l i u m i t sf u n c t i o nd e f i c i e n c y w e r ea s s o c i a t e dw i t ht u m o ri n v a s i o na n dm e t a s t a s i s e c a d h e r i nw a si n v o l v e di nt h e r e g u l a t i o no fe p h a 2l i g a n d b i n d i n ga n ds u b s e q u e n td e g r a d a t i o n , t h e r e b yi n d i r e c t l y r e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no fe p l 妣p r o t e i n , e p l 础f u n c t i o n a la c t i v a t i o nd e p e n d e do n 4 一一_ t h ea p p r o p r i a t ee - c a d h e r i np r o t e i ne x p r e s s i o na n df u n c t i o n a lo r i e n t a t i o n h u m a n e p h a 2l o c a t e do nc h r o m o s o m el p 3 6 1 r e c e n ts t u d i e sh a v es h o w nt h a t ，i i l m a n yt u m o rt i s s u e s ，e p h a 2w a so v e r e x p r e s s e d ，i np a r t i c u l a ri n1 1 i 曲i n v a s i v er l n l o r c e l l s r e c e n t l y , s t u d i e sf o u n dt h a te p h a 2w a sh i g h l ye x p r e s s e di ng a s t r i cc a n c e ra n d r e l a t e dw i t hg a s t r i cc a n c e ri n v a s i o na n dl y m p hn o d em e t a s t a s i s , i nt h i ss t u d y , w eu s em g c 8 0 3c e l l st ot r yt oe x p l o r et h es i g n a l i n gp a t h w a y st h a t m i r _ 2 0 0 am a yb ei n v o l v e d w eh o p e dt of i n do u ts o m ee x p e r i m e n t a le v i d l ：n c ef o rt h , e d e v e l o p m e n to fg a s t r i cc a n c e rr e s e a r c h m a t e r i a l sa ndme t ho d s 1 、c h e m i c a ls y n t h e s i z e dr n i r - 2 0 0 aa n dt h ec o r r e s p o n d i n gn e g a t i v e c o n t r o lm i m i c s ： m i r - 2 0 0 a ：5 - u a a c a c u g u c u g g u a a c g a u gu 3 ； n e g a t i v ec o n t r o l ：5 - u u c u c c g a a c g u g u c a c g u t t _ 3 ， 2 、m g c s 0 3c e l lt r a n s f e c t e dw i t hm i r - 2 0 0 aa n dn cm i m i c s u s e s t e a m - l o o pr t - p c rt oc o n f i r mt h ee x p r e s s i o ne f f i c i e n c yo fe x o g e n o u s m i r - 2 0 0 a 3 、2 4a n d4 8h o u r sa f t e rt r a n s f e c t e dw i t hm i r n a m i m i c s ，t o t a lr n a w e r ee x t r a c t e db yt r i z o l ，r e v e r s et r a n s c r i p t e di n t oc d n a u s e r e a l , t i m e r t - p c rt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f z e b 2 ，e c a d h e r i n ，e p h a 2r n r n a 4 、2 4a n d4 8h o u r sa f t e rt r a n s f e c t e dw i t hm i r n a m i m i c s t o t a lp r o t q e i n w e r ee x t r a c t e d u s ew e s t e r nb l o tt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fe c a d h e r i ：n e p h a 2 a tt h ep r o t e i nl e v e l 5 、u s em g13 2t oi n h i b i tt h ed e g r a d a t i o no f e p h a 2p r o t e i n ，a n a l y z e t h er e g u l a t i o no f m i r - 2 0 0 ao ne p h a 2 d e g r a d a t i o n r e s u l t s 1 、d e t e c t i o no ft h ee x p r e s s i o ne f f i c i e n c ya f t e rt r a n s f e q c t e dw i t ht h e m i r - 2 0 0 aa n dn e g a t i v ec o n t r o lm i m i c s u s es t e a m - l o o pr t - p c rt od e t e c tt h e e x p r e s s i o no fm i r 2 0 0 a , t h em i r 2 0 0 a 5 t m n s f e c t e dg r o u pw a s18 3 8 士5 3f o l do ft h en e g a t i v ec o n t r o lt r a n s f e c t e dg r o u p s ot h e t r a n s f e c t e dm i r n am i m i c s w e r ee x p r e s s e ds u c c e s s f u l l y 2 、m i r - 2 0 0 ar e g u l m e dt h ee x p r e s s i o n0 tz e b 2i ng a s t r i cc a n c e rc e l l l i n em g c 8 0 3 m g c 8 0 3w e r et r a n s f e c t e dw i t l lm i r - 2 0 0 aa f t e r2 4h o u r s o v e r e x p r e s s e dm i r - 2 0 0 a d e p r e s st h ee x p r e s s i o no fz e b 2 z e b 2e x p r e s s i o nl e v e lw a s0 7f o l do ft h ec o n t r o l g r o u p w h i l e4 8h o u r sa f t e rt m n s f e c t i o n , o v e r e x p r e s s e d m i r - 2 0 0 ad e p r e s st h e e x p r e s s i o no f z e b 2 z e b 2e x p r e s s i o nl e v e lw a s0 7 1f o l do f t h ec o n t r o lg r o u p 3 、m i r - 2 0 0 ar e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no fe c a d h e f i ni ng a s t r i cc a n c e r e e l ll i n em g c 8 0 3 2 4a n d4 8h o u r sa f t e rt r a n s f e c t i o n , t h ee x p r e s s i o no fe - c a d h e r i nw a sh i g h e ri nt h e m g c 8 0 3c e l l st h a tt r a n s f e c t e dw i t hm i r 一2 0 0 at h a nt r a n s f e c t e dw i t hn e g a t i v ec o n t r 0 1 a tt h er n al e v e l ，e c a d h e r i ne x p r e s s i o no ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw a s2 3 81 ，6 3 3 7 f o l do ft h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p a tt h ep r o t e i nl e v e l s ，e - c a d h e r i ne x p r e s s i o no ft h e e x p e r i m e n t a lg r o u pw a s1 5 7 ，5 4 3f o l do ft h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p 4 、m i r - 2 0 0 ar e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no fe p h a 2i ng a s t r i cc a n c e rc e l l l i n em g c 8 0 3 2 4h o u r sa f t e rt r a n s f e c t i o n ，t h ee x p r e s s i o no fe p h a 2w a sh i g h e ri nm g c 8 0 3c e l l s t r a n s f e c t e dw i t hm i r - 2 0 0 at h a nt r a n s f e c t e d 、历t l ln e g a t i v ec o n t r 0 1 a tt h er n al e v e l ， e p h a 2e x p r e s s i o no ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw a s4 7 8f o l do ft h en e g a t i v ec o n t r o l g r o u p a tt h ep r o t e i nl e v e l ，e p h a 2e x p r e s s i o no ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw a s3 4f o l d o fm en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p w k l e4 8h o u r sa f t e rt r a n s f e c t i o n , t h ee x p r e s s i o no f e p m 2w a sal i t t l eh i g h e ri nm g c 8 0 3c e l l st r a n s f e c t e dw i t hm i r 2 0 0 at h a nt r a n s f e c t e d w i t hn e g a t i v ec o n t r 0 1 a tt h er n a l e v e l ，e p h a 2e x p r e s s i o no ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u p w a s1 3 9f o l do ft h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p a tt h ep r o t e i nl e v e l s ，e p h a 2e x p r e s s i o no f t h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw a s1 12f o l do ft h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p 5 、m i r 一2 0 0 am a yp a r t i a l l yn e u t r a l i z et h ee p h a 2p r o t e i nd e g r a d a t i o n p r o t e a s o m ei n h i b i t o rm g l3 2c a ni n h i b i tt h ed e g r a d a t i o no fe p h a 2 a m o n gt h e g r o u pt r a n s f e e t e dn c ，t h es a m p l et r e a t e d 晰t 1 1m g l 3 2h a dah i g he x p r e s s i o no fe p h a 2 ， a n dw a sa b o u t2 8 3f o l do ft h ec o n t r o lg r o u p b u ta f t e rt h et m n s f e ：c t i o nw i t hm i r - 2 0 0 a , 6 t h ei n h i b i t i o no fe p h a 2d e g r a d a t i o nd i s a p p e a r e d t h ee f f e c to fm g13 2w a sp a r t i a l l y o f f s e t e d a n dt h ee x p r e s s i o no fe p h a 2o ft h em g l3 2t r e a t e dg r o u pw a sa b o u t0 9 3f o l d o f t h ec o n t r o lg r o u p _ 、 l 0 n c i u s l o n l 、i ng a s t r i cc a n c e rc e l lm g c 8 0 3 ，m i r - 2 0 0 ai n h i b i t st h ee x p r e s s i o no fz e b 2a n d i n d u c e st h ee x p r e s s i o no fe c a d h e r i n 2 、i ng a s t r i cc a n c e rc e l l sm g c 8 0 3 ，t h eo v e r e x p r e s s i o no f m i r 一2 0 0 aa f t e r2 4h o u r s c o u l dl e a dt oam a r k e di n c r e a s e di nt h ee x p r e s s i o no fe p h a 2 w h i l ea f t e r4 8h o u r s ，t h i s i n c r e a s e de x p r e s s i o nw a sn o to b v i o u s 3 、h lm g c 8 0 3c e l l s ，2 4t o4 8h o u r sa f t e rt r a n s f e c t e dw i t hm i r - 2 0 0 aa n dn c ， m i r - 2 0 0 aa c t i v a t e dt h ed e g r a d a t i o no fe p h a 2 k e y w o r d g a s t r i cc a n c e r , m i r - 2 0 0 a ，e p h a 2 ，e c a d h e r i n 7 英文缩略语 8 论文 胃癌细胞m g c 8 0 3 中m i r 2 0 0 a 作用机制的初步研究 刖罱 胃癌是源自胃粘膜上皮的恶性肿瘤，在我国发病率死亡率均较高，因其侵袭 转移能力强，导致预后不佳，是患者死亡的重要原因。胃癌的侵袭、转移是一个 多步骤、多阶段、多因素的复杂过程，涉及多种癌基因及抑癌基因的表达改变、 基因突变以及细胞周期调控异常等方面。目前，微小r n a ( m i c m r n a ，m i r n a ) 介导的转录后基因沉默( p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) 成为胃癌进展 机制的又一可能原因，受到越来越多的关注。 m i c r o r n a s 是真核生物体内的一种长约为2 1 - 2 5 个碱基的非编码单链小分 子r n a ，通过与其目标m r n a 分子的3 端非编码区域( 3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ， 3 u t r ) 互补匹配导致该m r n a 分子的降解或翻译受到抑制卜3 1 。m i r n a 参与调 控个体发育、细胞凋亡、细胞增殖和分化等生命活动 4 。6 1 ，与肿瘤的发生、转移、 耐药等病理进程密切相关【7 ，8 1 。研究表明，多数m i r n a 在常见肿瘤组织中有不同 程度上调或下调，并通过调控细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移和血管生成等生命 过程中肿瘤相关基因的表达，参与肿瘤的发生、发展和预后【9 _ 2 1 。大量研究表明 m i r n a 表达的改变可以促进或抑制肿瘤的发生，在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、 结直肠癌等多种肿瘤中已经得到证实。 一本实验室前期利用多重连接依赖式探针扩增( m u l t i p l e xl i g a t i o n - d e p e n d e m p r o b ea m p l i f i c a t i o n , m l p a ) 技术对5 0 例胃癌组织进行基因组水平的分析，发现 有5 8 的病例存在染色体l p 3 6 区域的缺失，提示该区域可能存在胃癌特异性的 抑制基因或调控序列。多种人类m i r n a 基因定位于该区域，包括研究较为深入的 m i r - 2 0 0 家族。m i r - 2 0 0 家族包含两类m i r n a 簇，m i r 2 0 0 b 2 0 0 a 4 2 9 定位于染色 体l p 3 6 ，而m i r - 2 0 0 c 1 4 1 定位于染色体1 2 p 1 3 。m i r - 2 0 0 家族在多种常见肿瘤中 表达下调，且与肿瘤的侵袭转移密切相关。m i r 2 0 0 a 作为其中重要的一员，在乳 腺癌、卵巢癌及结肠癌细胞中的研究初步揭示了其抑癌的功能：m i r - 2 0 0 a 可通过 9 调节e - e a d h e r i n 转录抑制因子z e b 2 的转录水平，间接调节e c a d h e r i n 的表达， 抑制肿瘤细胞的迁移，抑制上皮向间质转化( e p i t h e l i a lt om e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n , e m t ) 1 3 - 1 s ，但在胃癌中上述途径尚未报道。e c a d h e r i n 是细胞粘附分子c a d h e r i n 家族成员，对于上皮的形成和维持具有重要作用【19 1 ，其功能缺失与肿瘤的侵袭和 转移有关【2 0 】。有研究表明：e c a d h e r i n 参与调控e p h a 2 与其配体的结合及后续降 解，从而间接调控e p h a 2 蛋白表达；e p h a 2 的功能活化也依赖于适当的e - c a d h e r i n 蛋白表达及功能定位【2 1 2 2 1 。e p h a 2 是酪氨酸激酶家族受体中的重要成员，其在胃 癌组织中高表达，且与胃癌的侵袭和淋巴结转移相关【2 4 1 。但m i r - 2 0 0 a 在胃癌中是 否发挥抑癌功能，是否通过z e b 2 e c a d h e r i n e p h a 2 途径发挥作用，这些问题还不 清楚。 本实验室前期研究中，应用实时定量r t - p c r 检测了m i r - 2 0 0 a 在胃粘膜上皮 细胞系g e s 1 和胃癌细胞系s g c 7 9 0 1 、m g c 8 0 3 、b g c 8 2 3 和a g s 中的表达，结 果发现与g e s 1 相比，m i r - 2 0 0 a 在a g s 中高表达，在m g c 8 0 3 和b g c 8 2 3 中表 达较低，在m g c 8 0 3 中表达最低。本研究选取m i r - 2 0 0 a 表达最低的m g c 8 0 3 细 胞为研究对象，试图探讨m i r - 2 0 0 a 在胃癌中的作用及可能参与的信号途径，以期 为胃癌发生发展及侵袭转移研究提供一定的实验依据。 实验材料和方法 一、实验材料 ( ) 主要试剂 1 、r n a 实验相关试剂 焦碳酸二乙酯( d e p c ) 、t r i z o l 试剂为s i g m a 公司产品。反转录试剂盒 p r i m e s c r i p t r tr e a g e n t 鼬为大连宝生物公司产品。 2 、m i r n a 化学合成的m i r 一2 0 0 a 和m i r - 2 0 0 a 相应无关序列对照( n e g a t i v ec o n t r o l ，n c ) m i m i c s 购自上海吉玛公司。 3 、细胞培养相关试剂 胃癌细胞系m g c 8 0 3 为本室自存。r p m l l 6 4 0 培养基( g i b c o ，u s a ) ；消化 1 0 液：0 2 5 t r y p s i n ( g i b c o ，u s a ) + 0 0 2 e d t a ：细胞冻存液：r p m l l 6 4 0 培养 液+ 2 0 胎牛血清+ 1 0 d m s o ( s i g m a ，u s a ) ：胎牛血清为天津生物公司产品。 转染试剂l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 购自i n v i t r o g e n 公司。 4 、实时定量p c r 相关试剂 实时定量p c r 染料s y b r p r e m i x e xt a 严陆为大连宝生物公司产品。 5 、抗体 a n t i e p h a 2 购自m i l l i p o r e 公司，a n t i - e c a d h e f i n 购自s a n t ac r u z 公司， a n t i 1 3 t u b u l i n 购自s i g m a 公司。 6 、其它试剂 蛋白酶体抑制剂m g l 3 2 购自m e r c k 公司。e c l 试剂盒购自p i e r c e 公司。t r i s 碱，s d s ，甘氨酸，n p 4 0 ，叠氮钠，脱氧胆酸钠，t w e e n2 0 ，b s a ，甲醇，冰乙 酸，考马斯亮蓝g 一2 5 0 ，显影液，定影液，无水乙醇等购自华美公司。丙烯酰胺、 p m s f 购自s i g m a 公司，t e m e d 和过硫酸胺，购自p r o m e g a 公司，n ，n 一亚甲 基双丙烯酰胺为u s b 公司产品。p 巯基乙醇，p v d f 膜购自m i l l i p o r e 公司。 ( 二) 主要仪器设备 1 、光学显微镜( o l y m p u s ，j a p a n ) 2 、高速离心机( e p p e n d o r f , g e r m a n y ) 3 、b i o f u g es t r a t o s 高速低温离心机( s o r v a u ，u s a ) 4 、r o t o rg e n e2 0 0 0 实时定量p c r 仪( c o r b e t tr e s e a r c h ，a u s ) 5 、电泳仪2 0 0 2 0 ( b i o r a d ，u s a ) 6 、水平摇床( g f l ，u s a ) 7 、s e r i e si iw a t e rj a c k e t e dc 0 2i n c u b a t o r 细胞培养箱( t h e r m a l ，u s a ) 8 、b i o r a dw e s t e r nb l o t 实验系统( b i o r a d ，u s a ) 9 、超净工作台( a i r t e c h ，苏州) 1 0 、倒置显微镜( c a s i o ，j a p a n ) 1 1 、超纯水装置( m i l l p o r em i l l q ，u s a ) 1 2 、制冰机( z i g e r a2 b e 7 0 2 5 ，g e r m a n y ) 二、实验方法 ( 一) m g c 8 0 3 细胞的培养 m g c 8 0 3 细胞用含1 0 胎牛血清的r p m i1 6 4 0