甘露醇脱氢酶的分离纯化及表征.doc

甘露醇脱氢酶的分离纯化及表征L. pseudomesenteroides的无细胞提取物（25克，湿重）在0缓慢加入硫酸铵至55饱和度。达到平衡状态后，将溶液在冰上搅拌另外1小时，通过离心分离除去沉淀的蛋白质，在30000g下和4下进行20分钟。将所得的上清液被施加到苯基Sepharose HP柱（Amersham Pharmacia Biotech公司），用缓冲液A（50 mM的KPI pH值6.5;1 mM的DTT;1.7M硫酸铵）由负硫酸铵通过.混合缓冲液A和缓冲液B（50毫米KPI pH值6.5; 1mM DTT）。1.7米到0M的梯度洗脱。酶催化活性组分之间洗脱用0.54 M和0.3M的硫酸铵; 这些组分是汇集并通过超滤浓缩至5毫升。用缓冲液C（20毫米的KPI pH值6.5;1毫米DTT）通过反复稀释和超滤浓缩脱盐准备。为进一步纯化，在4下进行色谱分离步骤，浓缩酶样品装入用缓冲液C平衡过的和用缓冲液D（20mM的KPI pH值6.5;1毫米DTT;600 mM NaCl）步骤梯度洗脱后的Q-Sepharose HP 5毫升柱（Amersham Pharmacia Biotech公司）中。酶活性之间洗脱用0.32 M和0.37 M氯化钠，并浓缩至2.5ml超滤。酶的分离是通过反复稀释和控制浓度达到的，通过装有一个单P列（Amersham公司Pharmacia Biotech公司）的缓冲液C平衡的，用缓冲液D按梯度洗脱。主动式甘露醇2 - 脱氢酶用0.39M的NaCl洗脱。酶活性的pool通过超滤浓缩至2毫升。分离物被加载在Superdex200 pg柱（Amersham Pharmacia Biotech公司）用缓冲液E（50毫米KPI pH值7.0;1毫米DTT平衡，之后100 mM NaCl用相同的缓冲液洗脱。酶活性池通过超滤浓缩至2毫升，通过反复的稀释和浓度的缓冲液C脱盐, 浓缩的酶分离物加载到Mono P柱（Amersham Pharmacia Biotech）平衡用缓冲液F（25mM的哌嗪-洗脱缓冲液G氯pH值为5.5，1mM的DTT）和溶剂（1:10 Polybuffer74-CL pH值4.01毫米DTT）。Polybuffer74（Amersham公司Pharmacia Biotech公司）是一种两性电解质产生pH梯度弱阴离子交换单P. 酶活性池与一体积的缓冲液（100mM的KPIpH值7.5;2mM的DTT）中和并用在2 ml-的CentriconYM-10（的Amicon/ Millipore公司）浓缩至1毫升。通过反复的稀释和缓冲E将缓冲液置换.活性酶浓度样品储存于无论4或者20下在都存在1毫米DTT。SDS-PAGE电泳，满分根据Laemmli的方法进行（1970），用于可视化的酶的纯化度范例和估计的亚基的分子质量。凝胶进行染色的Schgger和von Jagow（1987）的方法。作为分子量标准，预混蛋白质分子分子量标准（罗氏）。甘露醇2 - 脱氢酶的等电点的测定是进行色谱聚焦点（pI），和测量酶促活性的pH值分数。对于估计的分子量（斯托克斯半径）原酶，使用HiLoadTM26/60 Superdex200 pg列（Amersham Pharmacia Biotech公司），与标准的校准蛋白质的凝胶色谱法（Roche公司）（