细胞内蛋白质的合成与运输_论文.doc

细胞内蛋白质的合成与运输摘要：蛋白质是一切生命的物质基础，这不仅是因为蛋白质是构成机体组织器官的基本成分，更重要的是蛋白质本身不断地进行合成与分解。这种合成、分解的对立统一过程，推动生命活动，调节机体正常生理功能，保证机体的生长、发育、繁殖、遗传及修补损伤的组织。根据现代的生物学观点，蛋白质和核酸是生命的主要物质基础。关键字：多肽链、蛋白质、翻译、核糖体、运输途径、运输方式，研究前景前言：国家重大科学研究计划对中国的四项重要科学研究所涉及的领域分别作了详细说明，四个项目分别是蛋白质研究，量子调控研究，纳米研究，发育与生殖研究。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA 蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控，翻译水平调控，翻译后水平调控。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。一、蛋白质生物合成过程 白质生物合成亦称为翻译（Translation），即把mRNA分子中碱基排列顺序转变为蛋白质或多肽链中的氨基酸排列顺序过程。这也是基因表达的第二步，产生基因产物蛋白质的最后节段。不同的组织细胞具有不同的生理功能，是因为它们表达不同的基因，产生具有特殊功能的蛋白质，参与蛋白质生物合成的成份至少有200种，其主要体第主要由mRNA、tRNA、核糖核蛋白体以及有关的酶和蛋白质因子共同组成原核生物与真核生物的蛋白质合成过程中有很多的区别，真核生物此过程更复杂，下面着重介绍原核生物白质蛋合成的过程，并指出真核生物与其不同这处。蛋白质生物合成可分为五个阶段，氨基酸的活化、多肽链合成的起始、肽链的延长、肽链的终止和释放、蛋白质合成后的加工修饰。翻译不同mRNA序列的分子大小和碱基排列顺序各不相同，但都具有5-端非翻译区、开放阅读框架区、和3-端非翻译区；真核生物的mRNA的5-端还有帽子结构、3-端有长度不一的多聚腺苷酸（polyA）尾。帽子结构能与帽子结合，在翻译时参与mRNA在核糖体上的定位结合，启动蛋白质生物的合成；帽子结构和ployA尾的作用还有稳定RNA；开放阅读框架区与编码蛋白质的基因序列相对应。 遗传密码表在mRNA的开放式阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸或其他信息，这种三联体形势称为密码子（codon）。如图，通常的开放式阅读框架区包含500个以上的密码子。 遗传密码的特点一方向性：密码子及组成密码子的各碱基在mRNA序列中的排列具有方向性（direction），翻译时的阅读方向只能是53。 二连续性：mRNA序列上的各个密码子及密码子的各碱基是连续排列的，密码子及密码子的各个碱基之间没有间隔，每个碱基只读一次，不重叠阅读。 三简并性：一种氨基酸可具有两个或两个以上的密码子为其编码。遗传密码表中显示，每个氨基酸都有2,3,4或6个密码子为其编码（除甲硫氨酸只有一个外），但每种密码子只对应一个氨基酸，或对应终止信息。 四通用性：生物界的所有生物，几乎都通用这一套密码子表 五摆动性：tRNA的最后一位，和mRNA的对应不完全，导致了简并性氨基酸活化在进行合成多肽链之前，必须先经过活化，然后再与其特异的tRNA合，带到mRNA相应的位置上，这个过程靠tRNA合成酶催化，此酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合，生成各种氨基酰tRNA.每种氨基酸都靠其特有合成酶催化，使之和相对应的tRNA结合，在氨基酰tRNA合成酶催化下，利用ATP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA的氨基酸臂（即3-末端CCA-OH）上（图1）。原核细胞中起始氨基酸活化后，还要甲酰化，形成甲酰蛋氨酸tRNA，由N10甲酰四氢叶酸提供甲酰基。而真核细胞没有此过程。前面讲过运载同一种氨基酸的一组不同tRNA称为同功tRNA。一组同功tRNA由同一种氨酰基tRNA合成酶催化。氨基酰tRNA合成酶对tRNA和氨基酸两者具有专一性，它对氨基酸的识别特异性很高，而对tRNA识别的特异性较低。氨基酰tRNA合成酶是如何选择正确的氨基酸和tRNA呢？按照一般原理，酶和底物的正确结合是由二者相嵌的几何形状所决定的，只有适合的氨基酸和适合的tRNA进入合成酶的相应位点，才能合成正确的氨酰基tRNA。现在已经知道合成酶与L形tRNA的内侧面结合，结合点包括接近臂，DHU臂和反密码子臂（图2）。氨基酰tRNA合成酶与tRNA的相互作用，可见氨酸接受柄、乍看起来，反密码子似乎应该与氨基酸的正确负载有关，对于某些tRNA也确实如此，然而对于大多数tRNA来说，情况并非如此，人们早就知道，当某些tRNA上的反密码子突变后，但它们所携带的氨工酸却没有改变。1988年，候稚明和Schimmel的实验证明丙氨酸tRNA酸分子的氨基酸臂上G3：U70这两个碱基发生突变时则影响到丙氨酰tRNA合成酶的正确识别，说明G3：U70是丙氨酸tRNA分子决定其本质的主要因素。tRNA分子上决定其携带氨基酸的区域叫做副密码子。一种氨基酰tRNA合成酶可以识别以一组同功tRNA，这说明它们具有共同特征。例如三种丙氨酸tRNA（tRNAAlm/CUA,tRNAAim/GGC,tRNAAin/UGC都具有G3：U70副密码子。）但没有充分的证据说明其它氨基酰tRNA合成酶也识别同功tRNA组中相同的副密码子。另外副密码子也没有固定的位置，也可能并不止一个碱基对。 多肽链合成核蛋白体大小亚基，mRNA起始RNA和起始因子共同参与肽链合成的起始。 1、大肠杆菌细胞翻译起始复合物形成的过程： 核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号部位：原核生物中每一个mRNA都具有其核糖体结合位点，它是位于AUG上游8-13个核苷酸处的一个短片段叫做SD序列。这段序列正好与30S小亚基中的16S rRNA3端一部分序列互补，因此SD序列也叫做核糖体结合序列，着核糖体mRNA上AUG的正确位置来起始肽链的合成，该结合反应由起始因子3（IF-3）介导，另外IF-1促进IF-3与小亚基的结合，故先形成IF3-30S亚基-mRNA三元复合物。 30S前起始复合物的形成：在起始因子2作用下，甲酰蛋氨酰起 始tRNA与mRNA分子中的AUG相结合，即密码子与反密码子配对，同时IF3从三元复合物中脱落，形成30S前起始复合物，即IF2-3S亚基-mRNA-fMet-tRNAfmet复合物，此步需要GTP和Mg2+参与。70S起始复合物的形成：50S亚基上述的30S前起始复合物结合，同时IF2脱落，形成70S起始复合物，即30S亚基-mRNA-50S亚基-mRNA-fMet-tRNAfmet复合物。此时fMet-tRNAfmet占据着50S亚基的肽酰位。而A位则空着有待于对应mRNA中第二个密码的相应氨基酰tRNA进入，从而进入延长阶段。 2、真核细胞蛋白质合成的起始真核细胞蛋白质合成起始复合物的形成中需要更多的起始因子参与，因此起始过程也更复杂。 需要特异的起始tRNA即，-tRNAfme，并且不需要N端甲酰化。已发现的核起始因有近10种（eukaryote Initiation factor,eIF） 起始复合物形成在mRNA5端AUG上游的帽子结构，（除某些病毒mRNA外） ATP水解为ADP供给mRNA结合所需要的能量。 真核细胞起始复合物的形成过程是： 翻译起始也是由eIF-3结合在40S小亚基上而促进80S核糖体解离出60S大亚基开始，同时eIF-2在辅eIF-2作用下，与Met-tRNAfmet及GTP结合，再通过eIF-3及eIF-4C的作用，先结合到40S小亚基，然后再与mRNA结合。mRNA结合到40S小亚基时，除了eIF-3参加外，还需要eIF-1、eIF-4A及eIF-4B并由ATP小解为ADP及Pi来供能，通过帽结合因子与mRNA的帽结合而转移到小亚基上。但是在mRNA5端并未发现能与小亚基18SRNA配对的S-D序列。目前认为通过帽结合后，mRNA在小亚基上向下游移动而进行扫描，可使mRNA上的起始密码AUG在Met-tRNAfmet的反密码位置固定下来，进行翻译起始。 肽链的延长、终止和释放多肽链的延长在多肽链上每增加一个氨基酸都需要经过进位，转肽和移位三个步骤。为密码子所特定的氨基酸tRNA结合到核蛋白体的A位，称为进位。氨基酰tRNA在进位前需要有三种延长因子的作用，即，热不稳定的E（Unstable temperature,EF）EF-Tu，热稳定的EF(stable temperature EF,EF-Ts）以及依赖GTP的转位因子。EF-Tu首先与GTP结合，然后再与氨基酰tRNA结合成三元复合物，这样的三元复合物才能进入A位。此时GTP水解成GDP，EF-Tu和GDP与结合在A位上的氨基酰tRNA分离。 多肽链合成后的加工修饰1一级结构的加工修饰N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除。其过程是： 去甲酰化； 去蛋氨酰基。 氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等。 二硫键的形成：由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。 肽段的切除：由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。 2高级结构的形成构象的形成：在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下，形成特定的空间构象。 亚基的聚合。辅基的连接。 3靶向输送蛋白质合成后，定向地被输送到其执行功能的场所称为靶向输送。大多数情况下，被输送的蛋白质分子需穿过膜性结构，才能到达特定的地点。因此，在这些蛋白质分子的氨基端，一般都带有一段疏水的肽段，称为信号肽。分泌型蛋白质的定向输送，就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP）识别并结合后，将所携带的蛋白质送出细胞。 信号肽假说：信号肽位于新合成的分泌蛋白N端。对分泌蛋白的靶向运输起决定作用。细胞内的信号肽识别颗粒（SRP）识别信号肽，使肽链合成暂时停止，SRP引导核蛋白体结合粗面内质网膜；SRP识别、结合内质网膜上的对接蛋白，水解GTP使SRP分离，多肽链继续延长；信号肽引导延长多肽进入内质网腔后，经信号肽酶切除。分泌蛋白在高尔基体包装成分泌颗粒出胞二、蛋白质运输的途径细胞内蛋白质有多种运输途径，一般可分为三种类型：1、翻译后转运的蛋白质运输途径：蛋白质在核糖体上合成后释放到细胞质基质中，其中一些蛋白质不带分选信号，就留在细胞质基质中；而大多数蛋白质带有分选信号，将按其分选信号种类分别转运到细胞的不同部位。由于这种转运是在蛋白质分子完全合成后进行的，因此称为翻译后转运。属于这种蛋白质运输途径的主要有：（1）蛋白质从细胞质基质通过核孔复合体到细胞核的运输；（2）蛋白质从细胞质基质到线粒体的运输；（3）蛋白质从细胞质基质到过氧化物酶体的运输。2、共翻译转运的蛋白质运输途径：蛋白质在核糖体上合成过程中转移到内质网，即在核糖体上多肽链开始合成不久，在N-末端形成的信号肽引导核糖体附着到内质网膜上，信号肽穿入内质网腔并继续其合成过程，新合成的多肽链可游离于内质网腔内成为可溶性蛋白，也可插入内质网膜成为跨膜蛋白。以这种方式合成的蛋白质除一部分留在内质网外，大部分将运送到高尔基体，在那里作进一步分选和运输。由于这种转运是在蛋白质合成过程中进行的，因此称为共翻译转运。属于这种蛋白质运输途径的主要有：（1）蛋白质从内质网经高尔基体到细胞外的运输，称为生物合成-分泌途径；（2）蛋白质从内质网经高尔基体到溶酶体的运输。3、蛋白质的胞吞途径：细胞通过胞吞作用摄取细胞外蛋白质和其他大分子，进入胞吞小泡，并进一步经内体运送到溶酶体，在那里大分子被降解，降解产物进入细胞质基质为细胞利用，这种蛋白质运输途径称胞吞途径。蛋白质在细胞质基质与细胞器或细胞核之间、细胞器与细胞器之间以及细胞内与细胞外之间的运输有三种不同的方式，即门控运输、穿膜运输和小泡运输。（一）门控运输：蛋白质在细胞质基质与细胞核之间的运输通过核孔复合体进行，核孔复合体象一扇能选择性开放的门，对核质之间的物质交换进行调控，因此把这种蛋白质运输方式称为门控运输。门控运输既具有选择性，又具有双向性。小分子物质可以自由地通过核孔复合体，在核质之间是一种被动运输；而大分子物质通过核孔复合体则是一种耗能的主动运输过程。（二）穿膜运输：穿膜运输主要发生在细胞质基质与细胞器之间，蛋白质穿过细胞器的膜从细胞质基质进入细胞器内。蛋白质穿膜运输的靶细胞器界膜中存在一种特殊的蛋白质转运子，其功能是识别蛋白质的分选信号并邦助其穿膜。一般情况下，要穿膜的蛋白质必须呈非折叠状态才能完成穿膜运输，但也有一些蛋白质可以在折叠状态下穿膜。蛋白质从细胞质基质进入内质网、线粒体和过氧化物酶体都采用穿膜运输方式。（三）小泡运输：细胞器之间通过运输小泡进行的蛋白质运输称为小泡运输。从内质网到高尔基体、从高尔基体一个膜囊到另一个膜囊、从高尔基体到晚期内体和细胞表面以及从细胞表面到溶酶体的蛋白质运输都是通过小泡运输方式来实现的。运输小泡直径为50-100nm，它从一个细胞器以芽生方式形成，小泡内装着运输的蛋白质，小泡膜内装着膜蛋白，当它到达靶细胞器时即与其融合，将蛋白质从一个细胞器运送到另一个细胞器。蛋白质在细胞内的运输方式是由蛋白质分子上的分选信号决定的。在门控运输时，蛋白质分子上的分选信号与位于核孔复合体部位的相应受体特异结合才能介导主动运输；在穿膜运输时，蛋白质分子上的分选信号必须被靶膜中相应的蛋白质转运子所识别，否则不能穿膜；在小泡运输中，蛋白质分子上的分选信号与运输小泡膜上特殊受体合，然后作定向运输。三、蛋白质的研究前景 在医药方面许多蛋白质工程的目标是设法提高蛋白质的稳定性。在酶反应器中可延长酶的半衰期或增强其热稳定性，也可以延长治疗用蛋白质的贮存寿命或重要氨基酸抗氧化失活的能力。在这个领域已取得了一些重要研究成果。用蛋白质工程来改造特殊蛋白质为制造特效抗癌药物开辟了新途径。如人的-干扰素和白细胞-是两种抗癌作用的蛋白质。但在它们的分子结构中，有一个不成对的基因，是游离的，因而很不稳定，会使蛋白质失去活性。当通过蛋白质工程修饰这种不稳定的结构就可以提高这两种抗癌物质的生物活性。美国的公司成功地修饰了这两种治疗癌瘤的蛋白质，大大提高了它们的稳定性，已用于临床试验并取得了良好的效果。具有抗癌作用的蛋白质工程产品免疫球蛋白质是一种高效治癌药物，它能成为征服癌症的“生物导弹”，即具有对准目标杀死特定癌细胞而不伤害正常细胞的特效。近年来，澳大利亚医学科学研究所的一个微生物研究课题组经过多年的研究后发现了激发基因开始或停止产生癌细胞的蛋白质。这种蛋白质在癌细胞生长过程中对癌基因起着开通或关闭的作用。这个发现，对于通过蛋白质工程研制鉴别与控制多种类型的血液癌、固体癌的蛋白质有很好的作用，并为诊断和治疗癌症提供了新的方法。目前，应用蛋白质工程研究开发抗癌及抗艾滋病等重大疑难病症等方面，均取得了重大进展。另据实验，蛋白质工程还可以改变抗胰蛋白（）。运用此工程技术在的和之间切开后，可以与嗜中性白细胞弹性蛋白酶迅速结合而引发抑制作用。在病理学的氧化条件下可导致变成蛋氨酸硫氧化物使不可能与弹性蛋白酶的弹性位点相结合。通过位点直接诱变，被代替就成为抗氧化疗法的突变体。含突变体的血浆静脉替代疗法已经用于产物基因缺陷疾病患者的治疗，并已取得明显疗效。 在农业方面蛋白质工程正在成为改造农业，大幅度提高粮食产量的新途径。如植物光合作用是利用白光能将二氧化碳转化成贮成能量淀粉，在植物叶片中普遍存在着一种重要的起催化作用的酶，它能固定住二氧化碳，这种酶叫核酮糖-二磷酸羧化酶。而这种酶具有双重性：它既能固定二氧化碳，又会使二氧化碳在光照条件下通过光呼吸作用损失一半，即光合效率只有。现在。这种酶的三维结构已经搞清楚了。参与研究的工作人员认为，可以通过蛋白质工程改造这种酶，控制其不利于人需要的一面，从而大大提高其光合作用效率，增加粮食产量。近年来，美国坎布里奇的雷普里根公司的科研人员立题，以蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，他们实施对微生物蛋白质结构进行修改，仅此一举，使微生物农药的杀虫率提高了倍。 在工业方面蛋白质工程在工业上的应用取得的成果亦是很多。现以改变酶的动力学特性研制出高效除污酶为例说明其应用价值。酶的动力学基本规律为：酶（）底物（）酶底物复合物（）酶（）产物（）在这个反应过程中有个速率常数：在稳态阶段，形成速率与分解速率相等，这个速率就是（常数）。在数值上，等于达到最大速率一半时的底物浓度。常在反应的初始阶段测定，反应进行中产物浓度将增加，则不可忽视，高浓度的底物会抑制酶活性。在底物低浓度时，酶的是关键的参数。如在枯草杆菌蛋白酶的活性位点内有一个残基，作为去污剂的一种组分，该酶要置于氧化条件下使用。利用位点直接诱变，用其他种氨基酸的任何一种取代这个，这些突变酶在活性方面大不相同，除了代替的突变酶外，其他突变酶的活性都下降，而值提高。含不可氧化氨基酸（如，或）的突变酶在