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筛选对青霉素具有高抗性的金黄色葡萄球菌【摘要】全球性的细菌抗生素抗药是近年来感染性疾病治疗所面临的一大难题，细菌可对某类抗菌药物产生抗药性，也可同时对多种化学结构各异的抗菌药物抗药。随着抗生素的应用日益广泛，细菌对一些常用的药物呈现不同程度的耐药性，细菌的抗药也越来越广。对于那些应用时间越长，使用范围越广泛的药物，细菌的耐药性往往越严重。抗药性的产生使正常剂量的药物不再发挥应有的杀菌效果，甚至使药物完全无效，从而给疾病的治疗造成困难，并容易使疾病蔓延。目前，多认为抗药性的产生是微生物基因突变造成的。抗药性变异一旦产生，就可以传给后代，并可以转移给原来没有抗药性的敏感菌，使抗药菌逐年增加。由于抗药性的产生往往与用药剂量不足、长期盲目使用抗生素等用药不当的作法有密切关系，所以合理用药是防止和减少抗药菌产生的重要一环。【关键词】青霉素 金黄色葡萄球菌【本组人员】【实验原理】耐药性（Resistanceto Drug） 又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。青霉素是细菌细胞壁的合成抑制剂,可杀死正在繁殖的细菌.在培养基里加入一定量的青霉素(在培养基还是液体的时候添加),然后把备选菌落涂布在培养基上,这样,其他对青霉素没有抗性的细菌不能生长,只有目标细菌能正常繁殖,故可达到分离目的.紫外线可使DNA形成胸腺嘧啶二聚体而使DNA结构发生改变,从而由于生物基因突变而使生物发生变异.本实验以紫外线作为诱变因素，照射剂量5min。再根据金黄色葡萄球菌在加有青霉素培养基上不能生长，只能在基本培养基中才能生长的原理，将对青霉素具有高抗性的金黄色葡萄球菌检出，再在添加相同浓度的青霉素的培养基中多次培养，可得对某浓度青霉素具有高抗性（抗药性）的金黄色葡萄球菌，然后用革兰氏染色法将高抗性菌加以鉴定。【实验准备】（一）菌种金黄色葡萄球菌斜面菌种（实验室提供）（二）培养基及试剂固体LB培养基（蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl5g、琼脂15g、水1000mL）、液体LB培养基（蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl5g、琼脂15g、水1000mL）、PB缓冲液（PH7.0）、注射用青霉素钠、1mol/LNaOH溶液、1mol/L HCl溶液。 （三）仪器及用具天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、试管、试管架、三角瓶、漏斗、分装架、移液管、培养皿、玻璃棒、烧杯、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、报纸、纱布、乳胶管、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心管、离心机、涂布器、紫外灯（30w）、电子天平。 【实验操作】（一） 金黄色葡萄球菌菌悬液的制备取一环金黄色葡萄球菌斜面菌种划线接种在装有固体LB培养基的平板上,37摄氏度培养1216h后挑取单菌落接入装有30mL液体LB培养基的试管中,37摄氏度,200r/min培养1216h,取此培养液0.5mL接入含有50mL液体LB培养基的250mL三角瓶中, 37摄氏度,200r/min培养24h(培养至对数期),将培养液离心(3000r/min,10min).弃上清液,菌体用PB缓冲液离心洗涤两次,最后用PB悬浮细胞,菌落计数器计数,使细胞浓度控制在107108/mL.（二）诱变处理取上述菌悬液2毫升于小培养皿中（直径6厘米），用紫外线照射20分钟（紫外线30w，距离30厘米）照射完毕后立即离心，收集细胞并避光保存。（三）菌种的浓缩将上述诱变处理过的细菌细胞接入含有50毫升LB培养基的250毫升的三角瓶中，37摄氏度，200r/min，培养24小时，离心收集细胞，并用PB缓冲液洗涤两次，用4毫升LB液体培养基悬浮细胞，取2毫升悬液接入50毫升的含有注射青霉素钠的（浓度为200ug/ml）液体LB培养基中，37摄氏度，200r/min培养34小时，离心，取沉淀，用PB洗涤两次后再用PB悬浮细胞制成细胞悬液，并用PB适当稀释，取10020ul稀释液涂布LB固体平板，2830摄氏度恒温培养1到2天，观察菌落的生长的情况。（四）对青霉素钠高抗性菌的筛选将上述的培养基上生长的菌株接种在的固体培养基上，培养方法同上，在培养的同时设置对照组，在普通培养基上培养菌株，同时培养23天后，约79代，然后进行对照观察。在实验组中所得的菌种与对照组中的菌中长势基本相同，则就是对青霉素钠具有高抗性的金黄色葡萄球菌。【实验结果分析】为使细胞均匀的接受紫外线的照射，细胞悬液必须均匀，而且浓度需保持在107108/mL.，诱变剂的计量也很重要，一般掌握在使诱变后的细胞存活率在5%6%为宜。诱变处理后发生突变而且具有高抗性的细胞知识少数的，大量的细胞仍然不具有高的抗性，故利用此性，将诱变的细胞悬液培养在含有青霉素的培养基中，从而淘汰不具有抗性的菌。凡能在含有青霉素的培养基上存的菌，即为诱变后具有抗性的金黄色葡萄球菌。【参考文献】1 用庆大霉素抗性筛选法选育西罗莫司高产菌株 作者张莉 贾啸静 中图分类号：R979.5 文献标识码：A 收稿日期：2006-10-272 黄瓜花粉管通道法抗虫基因导入及卡那霉素抗性筛选 魏爱民 张文珠 杜胜利 韩毅科 张桂华 华北农学报2008年 第6期3 几种新型高效低毒农药对小菜蛾的防治效果及抗性筛选研究何翠娟 陶岭梅 沈雁君 张有为 上海交通大学学报：农业科学版2008年 第4期4 链霉素抗性筛选吸水链霉菌高产农用抗生素菌株研究 彭祎 黄永春 蔡延明 曹仁林 安徽农业科学2008年 第18期5 苏云金杆菌HD1制剂对小菜蛾的抗性筛选及抗性特征 王成球 兰红霞 中国生物防治1999年 第1期 6 抗性筛选纤溶激酶菌株 程金权 潘红梅 冯文帅 王拥军 四川食品与发酵2003年 第2期7 复合诱变和抗性筛选高产谷胱甘肽酵母菌株