计算机在生命科学中的应用第四次作业2.doc

对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计 前言： PCR技术的的运用，要点包括三部分，模板、引物和体系。模板是扩增的基础，引物是PCR技术的关键点，在现在实验条件下，模板和体系一般都有商品化的技术支持，因此，能否设计出好的引物就成了PCR反映的关键1.利用软件Vector NTI Explore 对硫矿硫化叶菌DNA序列进行酶切找到含目的基因的较小的片段2.利用软件Vector NTI Explore进行引物设计引物 Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）的一段DNA 序列。3. 引物设计的原则： （1）长度在1835bp，GC含量在40%60%之间，内部无发卡结构，Tm值接近72； （2）引物之间避免形成二聚体； （3）引物3端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配； （4）在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时需要在引物的3端加上适当的酶切位点。 （5）引物3端不能选择A，最好选择T。 （6）引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 实验内容： 试验中用到的古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp是要得到的未知功能蛋白质的基因序列，利用Vector NTI Explorer分析酶切位点，依次用 PStI、EcoRI和ClaI处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，最后得到11429的DNA片段，是理想的PCR模板。再次使用Vector NTI Explorer分析，设计PCR引物，使用PCR扩增得到目的DNA。实验步骤：1, 要用限制性内切酶将多余的片段切去。找出目的基因所在的片段 这是Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）DNA序列利用软件Vector NTI所能找到的所有酶切位点：由给出的切割位点课已看出，在整条基因序列中PstI的切割微点只有一个，所以首先用此限制酶切割，可以得到3370bp之前的整条片段。这样做既不会切断需要的那一段基因序列，又可以切除掉大部分的不需要的片段。切完后，进行琼脂糖凝胶电泳法进行电泳，可以得到下图：在电泳过程中，DNA片段越大就跑的越慢，因为需要的是含有80-709bp的那一段，因此应当回收跑的快的那一段，即1-3370bp这一段 得到1-3370bp这一段基因序列后如果再次进行切割，那么所有的酶切位点如上图所示。未得到80-709bp片段就可以用EcoRI酶进行完全切割，这样可以得到1-1429bp、1429-2696bp、2696-3259bp、3259-3370bp这四个片段，长度为1429bp、1267bp、563bp、111bp，若为这样那么前两段长度相差很小，电泳时不易区分，于是要用ClaI进行双酶切隔。将1429-2696bp段再切为两段，长度分别为943bp、342bp，这样点勇士便于区分。可以比较容易的得到目的片段，即1-1429bp段。电泳如左图：， 同理可将1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶切位点AvaI，如图。用工具找它的ORF，ORF的分析结80709bp处， 1AAAATCTTCC AATTATTTCA GTAGTGTCTA TCTTTTAATA TGAAAAATTT TTGATGTTTT AGTTTGAAAA ATTTATTAAG TGAGAAAACA ACTCTCTATTTTTTAGAAGG TTAATAAAGT CATCACAGAT AGAAAATTAT ACTTTTTAAA AACTACAAAA TCAAACTTTT TAAATAATTC ACTCTTTTGT TGAGAGATAA 101GGAATGAAGA ATCTTTATAA AATTAACTTT TCAATATCAC ACCAAGGTTG CTGGACCAGC AAAATAAAAG ATAGTGTTGT TACCTTAAAT GTATCAAAATCCTTACTTCT TAGAAATATT TTAATTGAAA AGTTATAGTG TGGTTCCAAC GACCTGGTCG TTTTATTTTC TATCACAACA ATGGAATTTA CATAGTTTTA 201ATAATAATAA GAAAGTCAGA GTCACAATAG CTTCTCCAAA ATTAATAGTA ACTGACCTAA AAAGGTCAGA AAACGTTTAC GAAATTCTAA AGTATAGAAATATTATTATT CTTTCAGTCT CAGTGTTATC GAAGAGGTTT TAATTATCAT TGACTGGATT 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-36.7 kcal/molAntisense Primer: GAATTC GCAGATTTCCAGACAGAA Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 56.4 C GC: 41.7 dH: -177.6 kcal/mol dS: -459.1 cal/mol dG: -38.9 kcal/molTm Difference: 2.7GC Difference: 4.2#2: Product of length 765 (rating: 171) Contains region of the molecule from 80 to 832 Tm: 71.2 C TaOpt: 51.0 C GC: 29.7Sense Primer: CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 53.7 C GC: 45.8 dH: -170.4 kcal/mol dS: -442.4 cal/mol dG: -36.7 kcal/molAntisense Primer: GAATTC AGCAGATTTCCAGACAGA Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 54.2 C GC: 41.7 dH: -170.2 kcal/mol dS: -