基因打靶技术的原理及操作.pdf

艺4 Lette rs inBioteehn olog y1997 8 l H umanizatio nof m urin e m o n o elonalantibody Yu a n Qing a n Yu W eiyuan H u ang C uifen In stituteo fBio te ehnolog y Be ljing10 0850 A bstraetTho elln一 e ala p plle atlono f m urin e m o n o elo nala ntlbod一 es15 g r e atly hind ered be e auseo f h umana ntimou se antibodyr e spons e A h uman iz atl onstr ateg y ba sedon C D R 一gra fting hom ologou sa nalysisand m o l e eu lem odelin g h as be e n the effieients o l utio n tothis problem W er e viewed theprogr e ssesinthis field re eent yea r s Keywo rds hum an iz atio n CDR 一gr a fting m ole e u l e m o deling H AMA m o n oelonalantibody 基因打靶技术的原理及操作 卢柏松黄培堂 军事医学科学院生 物工程研究所 北京1 0 0 07 1 摘 要基因打靶是近几年发展起 来的一种通过同源重组定点 改变小 鼠基因组特定 位点 的技术 其诞生是 分子生物学与实验胚胎学方法相结合的产物 它的出现又导致了体 内研究与体外研究 分子生 物学与临床病理学的有机结合 为研究基因的体内功能和 疾病的致病机理提供了一种有力 的实验手段 本文以基因打靶的 实验过程为主线 介绍该技 术的原理 操作 进展 和应用 关键词基因打靶 同源重组 小鼠 基因打靶 g ene k n oeko ut g e n e targeting 中文也 称基因敲 除 指通过 DNA 分子 的同源重组 特异 性地 在基 因组 中的某个位点引人预 定的 突变 获得基因型 发生了改变 的基因打靶小 鼠 以研究目标基因的体内 功能或相关疾病的致病机理 基因打靶技术 中DNA同 源重 组发生 在 细胞水平 即胚胎 干细胞 emb ryo一de riv edStemc ells 简称 ES 细胞 然后通过 ES 细胞介导 改变了的基因组 传 递 给基 因打靶 小 鼠 因而 实际上 它是分子生物学和实验胚胎 学技术 具体而 言是基 因同源重组技术和构 建嵌 合小 鼠技术相结合的产物 从不同胚胎 构建嵌合小鼠的研究 始于本世纪6 0 年代 随后 1 98 1 年获得了体外连续传代的 Es 细胞 l j 1984 年实现了E s细胞以较高的概率发育成为嵌合小 鼠的生殖 细胞田 使得体外培养的 Es 细胞的基因型得 以遗传 基因同源重 组的研究 在低等生物 大肠杆 菌 酵 母 中开始较 早 在哺乳 动物细胞 中的研究 始于8 0 年代 198 5年首次证明了同源重组在哺乳动物细胞 中 的存在川 随后 基因打靶载体的设计尤其是正负选择系 统叫的提出 使同源重 组 的概率 大大提高 为在 E s细 胞中进行基因打靶奠定了基础 随后一些新的方法不 断出现 基因打靶已不再局 限于敲除某个基 因 而是可 以往基因组中引入精细突变 s 可以实现组织特异性和 发育阶段 特异性基因打靶 6 大大丰富了我们的研究手 段 基本原理和操作步骤 基因同源重组的原理和基因打靶操作流程分 别见 图1和 图2 为了在ES细胞中进行基因打靶 先构建一 个基因打靶载体 载体上含有与 ES 细胞基因组中目标 位 点 同源 的序列 同源序列中间插人了一个标志基因 通常是 n eo r 基因 将基因打靶载体引人 ES 细胞后 由于 D N A 同源重组 打靶载体 中的标志基因随着靶位 点的同源序列一同进人了ES细胞基因组 从而特异性 地改变了E S细胞基因组的一个等位基因 而其它 部分 不发生任 何改变 这里标志基因既是 同源重组事件发 生物技术通讯 1997 年第 8 卷第 1 期 25 生的一个筛选标志 又因其 插人而打 乱了靶基因的正 常功能 得到了基因组发生 了预期改变的ES细胞以后 用 这种 E S 细胞构建嵌 合小 鼠 并进一步获得纯合基因打 靶小 鼠 可见基因打靶大体上可以分为两个 阶段 第一 阶段是在E S细胞内进行基因同源重组 这一阶段主要 应用分子生物 学的技术方法 第二阶段则是构建 E S 细 胞来源 的基因打靶 小 鼠 这一阶段则主要依赖实 验胚 胎学方法 野生型等位塞因 革巴基因 打靶载体 发生同 源 重组以后 十 标志基 十 二二二二1 忽旺二二二 图1 基因打靶载体与 E s细胞基因组的同源重组 圈 砂 转 染 E S 细 制制备滋养养养养养养养养养 层层细 胞胞胞 ES 细 胞培养养 一 ES 细蒯亥 型分 一 巨 三 三 困 一 得 一 卜 筛筛 选 同源重组组 纯纯合基因打靶小鼠鼠 选选择插人事件件 图 2 基因打靶的实验流程 1 1E S 细胞中的同 源重组 正负选择系统 po sitive一n egative seleetion 基因打靶的关键在于 只特异性地 改变目标 基因 而基因组的其它位点不 受影 响 为此有 必要从大量发 生 了随机 整合的 ES 细胞 中挑 选出只发生了同源重 组 的E S细胞 由于同源重组在哺乳 动物细胞 中发生的概 率较低 约 10 一5 一个合适的筛选方法对于减 小工作 量是 十分必要 的 正负选 择系统川就是一种 能极大地 提高同源重组的比例 降低非 同源重组背景的一种方 法 其工作原理为 如果发 生的是同源重组 则只 有 n e o r 基因能进人 ES 细胞基因组 如果发生的是非同源 重组 则n eo r基因和单纯疤疹病毒H SV 一t k 基因同时 进人 E S 细胞基因组 在培养基 中 同时含有G4 1 8 和 G a n eyelovir 两种物 质的情况 下 由于HSV 一tk 基因的 表达产物能把 G a n o y cl o v i r 代 谢为一种有毒 物 质而 杀 死宿主细胞 因而只有 发生同源重组的E S细胞能够存 活 这 里 n e o 基因选择 发生 了重组的 ES 细 胞 而 HS V 一t k 基因去除发生了非同源重组 的ES细 胞 故名 正负 选择系统 据报导该选择系统可以使同源重组的 发生比例提高2一20 0 0倍 往 ES 细胞基因组中引入精细突变 上述基因打靶策 略虽然实现了目标基因的特异失 活 但显然存在以下不足 首先它 往基因组 中引人了一 个外源标志基因 这势必影响机体的正常功能 其次许 多时候我 们更希望了解目标基因不是 在完全失活而是 在发生了微小突变后的情形 这 就提出了往 ES 细胞基 因组中引人精细突变的要求 有多种方法可以达到这 一目的困 一9 由于篇幅的限制 这里只扼要介绍两步置 换法 d o u b l er eplaee m e nt 5 其工作原理 为 在打靶载 体中目标基因的中间插人 两个筛选标志基因n e o r和 HSV 一t k 通过第一次 同源重组n eo r和 H SV 一t k 基因进 人了 E S 细胞的靶位点 然后往细胞中引人含有预定突 Ietter sinB iot e ehn o l o gy1 99 7 8 1 变的目标基因 通过第二次 同源重组 含有突变的目标 基因进入了E S细胞 基因组 而n eo r和 HSV 一t k 基因又 被置换出来了 这样通过两次同源重组 目标基因发生 了预定的突变 而 E S 细胞基因组中不留下任何不必要 的成分 这里第一次同源重组以G 41 8 抗性为选 择标志 n e o 基因的存在 第二次同源重组以 G aneyelovir 抗 性为选择标志 HS V 一t k 基因不存在 ES细胞及 其培养 E S 细胞 表l 来 自于着床前囊胚 3 二5 天胚胎 的 内细胞团 其特点是多能性 和未定向性 也正是这 一特 点保证了ES细胞进 人受 体胚胎 后能发育成小鼠的各 种组织 其中包括生殖腺 ES 细胞对培养器材和试 剂 要求较 高 对器 材中残留的有毒 物质尤其是去污剂十 分敏感 因而所用的细胞瓶 血清甚至水都要 求是高质 量的 由于E S细胞在体外传代的次数过多会影 响其发 育 为生殖细胞的能力 因而应 尽可能减少 ES 细胞的体 外传代次数 E S 细胞的培养需要 滋养层细胞 后者功能之一是 作为 ES细胞附着的支持物 功能之 二则是 为 ES 细胞 提供抑制其分化 保持其多 能性的多肤信号 现已清楚 白血病抑制因子 I J F 就是滋养层细胞提供的抑制ES 细胞 分化的物质之一 滋养层细胞可用1 3一1 4天的小 鼠胚 胎成 纤维细胞充当 制备时将 适龄 小鼠胚胎肝和 脑组织去除后匀 浆即可 滋养层细胞应该只有有限的 增殖能力 为此可用 20拜g ml丝裂霉素C 处理 或者用 3OGy7 一 射线照射滋养层细胞 另外 由于 ES 细胞在筛 选过程中要 用 到G 41 8 等 物质 滋养层细胞 最好 能有 G 41 8 抗性 一些已有基 因打靶小鼠胚胎通常可以提供 有 G41 8 抗性的滋养层细胞 表 l 文献报道过的一些 ES 细胞株 l 0 口 名 称 基因型 来源小鼠品系 1 2 9S v 1 2 9S v 基因打靶载体的构建及转染 获得 足够长的靶基因的 基因组 DNA 是构建打靶 载体的先决条件 为了提高同源重组的效率 载体中靶 基 因的同源序列应该至 少在 Zk b 以上 实验 发现 同源 重组的效率与载体中同源序列的长度正 相关 将 同源 序列从4kb增加到 gkb 同源重组的效率提高40倍 另外 同源重组的效率还同 E S 细胞 中靶序列与载体中 同源序列的相似性 大小 有关 相似性越大 则同源重组 效 率越高 因而打靶载 体中靶 基 因的 同源序列应尽可 能来自与 E S 细胞同样品系的小鼠 J z 打靶栽体从插人 方式上可分为替换型载体和插入 型载体 前 者发生 同源 重组后只有 靶基因的同源序列 和中间的标志基因进人了E S细胞基因组 图 1 示意的 是 替换型载体同源重组 的情况 后者进人 E S 细胞基 因组的还包括打靶载体的其余部分 两者在结构上并 无本质差别 主要的差别在于替换型打靶载 体在同源 序列以外 的部分有一个单一酶切位点用于线性化 而 插人型载体线性化的位置位于同源序列内部 有报道 认为插人型载 体发生同源重 组的概率比替换型载体要 高些 构 建的打靶载体经线 性化以后 这样可以提高 同 源重组的频率 通常是用电穿孔法将 D N A 引人 ES 细 胞 该方法 的突出优点在于其可靠性和可重复性 转染 的条件因实验室不同而异 电压为 2 2 0一80 0v 电容从 0 3 到 5 仁F 不等 一般 转染 后2 4 小时开始 用含 2 0即9 G4 l8 或 和其它物质 的培养基进行选择培养 大约 过 8一1 2 天未整合外源DNA的ES细胞都已死 亡 而 整合了外源 DN A 的 E S 则长出了显微镜下 可见 到的克隆 筛选和鉴定 得到的克隆大部分是 打靶载体DNA随机 整合的 结果 虽然 采 用正负选 择 系统同源重组 的比例要高 些 因而下一步就是要从 中筛选 发生了同源重组的ES 细胞了 如前所述 ES 细胞的代数过大影响其发育为 生殖细胞的能力 因而如果筛选周期过长 则应 液氮冻 存 ES 克隆的一个拷贝 待鉴定完成后再行复苏 筛选 鉴定的方法包括 PC R 或S outhe rn Blot 或两 种方法 的 组合 PC R 通常是优先采用的方法 其 优点在于简单 快 捷 对模板DNA的制备要求不高 将 ES 细胞在8 0 的水 中加热 1 5m i n 即可 l a 由于Pc R引物一条 来 自打 靶载体上的标志基因 另一条 与ES细胞基因组中靶序 列附近 的序列配对 因而只有以发生 了同源重组的ES 细胞 D N A 为模 板 用这对引物才能 得 到预 期大小的 y y X X J lD 3 二CE1 2 9S v 1 29S v 1 2 9 01a y y X XA BI E 14TG Za 12 9 01a yy XXE1 4 l B L 6111 B r u e e 茎 T r Z C57B L 6 C5 7B L 6 C5 7 B L 6 XCB A JNC rJ yyXX 生物技术通讯 19 97 年第 8 卷第1期 D NA 产物 Pc R 也有一些缺点 当打靶载 体中靶基因同源序 列较长时 PC R 扩增长 片段的效率不够高 另外基因组 中大量重 复序列的存在也 容易引起假阳怪结果 这时 可采用S ou t he r n B l o t 法来进行筛选鉴定 该方法的原 理就是发生了同源重 组 的E S细胞 与发生 非 同源重组 的E s细胞其 D NA 经过合适的 限制 性 内切酶切 割后 在S o uthe rn Blot 中会得到不 同的带型 So uthe r n Blot 操 作起来比 PC R 要繁 杂些 周 期 较 长 对 ES 细胞 DN A 的要求也比较高 但结果清晰且可靠性较好 经Pe R或 和 s outhe rn Blot 筛选 到了发 生同源 重组 的E S细胞后 就可开 始构建嵌合小 鼠了 但在此 之前最好 分析获 得的 E S 细胞的核型以确保 其为整倍 体 4 0 条染色体 因为只有整倍体细胞才 一 能发育为生 殖细胞 1 2 嵌合小鼠的构建 构建 ES细胞和受体胚胎 形成的嵌合小 鼠是整个 基 因打靶 的关键步骤 也是限速步骤 有两种方法可以 使 ES 细胞进人 受体小鼠胚胎 即将ES细胞直接注人 小 鼠囊胚山 或者将E S细胞 与小 鼠桑堪胚共培养 l s 直接注人 法先分离到 3 5 天的小鼠囊胚 3 2细胞期 然后 在显微注射仪的帮助下 将2 0 个左右 ES 细胞直 接注人 囊胚的原胚腔 然后 将这 种囊 胚移植到假孕小 鼠子宫让 其继续发育 该方法 得到有 ES 细胞来源 的生 殖细胞的嵌合小 鼠的概率较 高 但要求有精 密的显微 注射仪 而且操作者要有十分熟练的技巧 共培养方法对仪器和操作者的熟 练程度要求相对 低些 该方法的根据是 ES 细胞很容易粘到 8一1 6 细胞 期的桑棋胚上 并参与胚胎各个组织的发育 实验时先 分离 8一1 6 细胞期的桑堪胚 用酶或酸处理去掉桑堪 胚周围的透明带后 将其与ES细胞共同培养 24 h 这过 程中E S细胞与胚胎细胞 发生粘聚并发育到囊胚期 再 将这种胚胎移植到假孕小鼠的子宫直至小鼠出生 由于受体胚胎和 E S 细胞分别来 自毛色不 同的 小 鼠品系 因而待移植小鼠出生 后 根 据其毛色是否杂合 便可判断其是否嵌合小 鼠 如果嵌合小鼠的生殖腺 中 有E S细胞来源的生殖细胞 将该嵌合小 鼠与受体小 鼠 回交 便可以得到其染色体的一半来自ES细胞的杂合 子代小 鼠 h ete roz g ou s 这种小 鼠靶 基因 的一个等位 基因是正常的 另一个等位基因则发生了人为的改变 杂合小鼠之 间的交配即 可得 到靶基因的两个拷贝都发 生 了改变的纯合基因打靶小鼠 1 3 小鼠体 内组织特异性基因打靶 上述基因打靶过程中 纯合基因打靶小鼠的靶基 因在整个发育阶段都是不正常的 而且 全 身任何组织 中靶基因都已改变 如果靶 基因对 小 鼠的胚胎发育至 关重要 这种 纯合基因打靶小鼠往往在 胚胎期或出生 不久死 亡 影响对靶基因功能的研究 另外 有时我们 希 望研 究靶基 因只在 特定组织被 改变后的生物效应 因 而组织特异性 基因打靶就显 得十分必要 Cr e 一lo x P重 组系统为组织特异性基因打靶提供了手段阶 Cr e 一 f o xP 是 见于 Pl 噬菌体的一种重组 系统 Cr e 是一种位点特异性重组酶 它 能催化两个 34bp 的lo x P 位点之间的重组 在 打靶载体标志基因和 目标基因两 端共引人三个f o xP 位点 然后让载体与 ES 细胞发生 同源重组 得到发生了同源重组的 E S细胞后 往细胞中 转 染Cr e基因让其瞬时表达 Cr e重组酶 在Cr e酶的作 用下三个lo x P 位点之间发生三种重组结 果 第一种重 组 发生 在l o x PI 与l o x P Z 之间 结果标志基因丢失 剩 下目标基因和其两端的f o x P 位点 这正是所要的结果 第二种发生在l o x P I 与l o x P3 之间 结果 标志基因和目 标基 因都丢失 第三种发生在 l xPZ与f o x P3 之 间 剩 下标志基因 由于HSV 一t k 基因的存在 可在培养基中 加人 G a nc ydo v i r 而将这种细胞杀死 取发生了第一种 同源重组的 E S细胞构建基因打靶小 鼠 然后将得到的 纯合基因打 靶小 鼠与预先制 备的只在特定 组织 表 达 Cr e 重组酶的小 鼠交配 便可得到组织特异性基因打靶 小 鼠了 这种小 鼠别的组织中目标基因正常表达 只在 特定组织目标基因被缺失 2 结束语 基因打靶技术是 分子生物学和实验胚胎学技术 相 结合的产物 它本 身又成 为联系分 子生物学 与病理学 体内研究与体外研究的 一个桥梁 因而在国外 被广 为 应用 几 年 中已有 超过 20 0 个基因应 用该手 段进 行 过 研究嘟 其应用包括用于研究 特定基因的体 内功能 作 为研究疾病致 病机理的动物模型山 用于治疗药物和 治疗方案的评价 l s 等 另外基因打靶技术 的一个潜在 的应用就是作为生产一些有重要经 济意义的生物大分 子的生物反应器山 总之 基因打靶技术正在使我们对 基因的功能和疾病的机理有一个 更 为全面的认识 也 将会在药物研究以及其它多方面作出贡献 参考文献 E vans MJ K a ufm an MH E sta blishm e nr in e ultu reo f plu ripotentiale ellsfrom m ouseem bryos N aru r e 1 981 28 l ette rs inBiote ehn o l o g y1 997 8 l 2 92 1 54 Br ad leyA E v ans M J K aufman MH etal Fo rm at一o nof ge rm 一line e him a e r as from em b ryo一de r 一 v edreratoe are 一n oma e el l lin es N atur e 1 984 309 2 5 5 Sm 一t11ze s o C regg R G Bog g s 5 5 et al Ins e rtio n ofD N A sequ e n c e s Inrothe h uma r lehro m o s omalbeta一globulin 10 e u s byhom ologo usr ee o r n bin arion N atu r e 1 9 8 5 3 1 7 2 3 0 M ans o ur 51 Thom as KR Cape e ehi MR D is r uptio n of the proto 一o n e ogene in t一2 inm ouseem bryo 一der iv ed stem e ells a gene r alstr ateg yfor ta rgeting m utatio n s in to 10 G all i一Taliadoro s LA S edg w iekJDW o od SAe t al G en 2kn o ek一o ut Inte r e sted teehnologya m ethodologlealo v e r y 一 ew fo r the no vie e Jlr n m o nolMethods 199 5 18 1 l 3 4 5 6 7 8 9 n on 一s ele etab le gene s Nature 1 98 8 33 6 348 W u H L iuX Ja enish R D o ubler ePi盛e ement Str ategy fo re ffie l e n tIntrodu etl o nofs u btlem utatlo ns into the m u r ln七 Col la 一1 ge n ebyhomologo u sre e om bin at一o n in em bryo niestemeells Pro e N atlAe ad SeiU S A 1 99 4 9 1 2 81 9 G u H M a rth JD O rban PC et al D eletionofa D NA polym e r a s e beta s egme ntIn T e el lsusinge el ltypespe e 一fie ge n e targeting 反i ene e 19 9 4 2 6 5 103 G u H Zh o u YR R ajewsky K Indep en den t eo ntrolof im m u noglobu lin sw iteh r ee om bin atio nat individu al sw一te h r egl洲5evi de n e edthrough Cr e 一lox P 一 m ed iatedgene targering Cel l 19 9 3 73 115 5 H asty P R a mir e z 一 SolisR K rum la uf R etal In rrodu et一 onofas ubtle m utatio n into the H o x 一2 6lo eu sin em b ryon一 e stem e ells N atur e 1 992 3 50 243 V a la n eiu s V Sm lthles T e stingan in一ou t ta rgetlng pr oeed u re fo rm akings ubtle ge nomie m od ifieationsIn m o u s eem bryo nie ster n e ells M ol Cell Biol 19 91 11 14 02 11 T h oma s KR Cap eee hiMR Sit e一dire ere dm utage n e sis by gene targeting 一n m o u s e e m bryo 一der i vede ells Cell s 1987 5 1 503 12 T e RieleH M a a ndag ER B e rns A H 一g hly effie le ntge n e ta rgeting jn em b ryon je ste m e el lsthrough hom ologo u s r e eom bin atio n withis og enie D NA eo nstr u ets Pro eN arl A ead SeiU S A 1 99 2 8 9 之 5128 1 3KimH S Sm 一thies 0 R eeom blnatio n fr agm en tass ay fo r ge n e ta rgeting ba sed on polym e r a s eehainr eactlon N u eIeie A eids R e s 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